结冷胶的研究进展
2006-09-17 16:57:01   来源：不详   评论：0 点击：

许多微生物在生长代谢过程中，能够合成附着在细胞表面或分泌到胞外溶液中的无定形黏液，即是微生物胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS ) ，又称微生物代谢胶。近年来，微生物胞外多糖以其安全无毒、理化性质优良等特性越来越受到食品、制药和化妆品等诸多行业的关注。到目前为止，已大规模生产的微生物胞外多糖主要有黄原胶(xanthan gum)、结冷胶(gellan gum),凝胶多糖(cardlan),葡聚糖(dextran),茁霉多糖(pullulan)、小核菌葡聚糖(scleroglucan)等，但被国际食品立法机构允许用做食品添加剂的微生物多糖迄今为止还只有黄原胶和结冷胶2种[2]。
    结冷胶是美国Kelco公司继黄原胶之后开发成功的又一种微生物胞外多糖，过去曾称杂多糖PS-60,于20世纪70年代末发现，直到1982才有了有关结冷胶实验室规模发酵生产成功的报道[3]。后来该公司利用伊乐假单胞菌为生产菌把结冷胶作为一项产品止式投人生产[3]。由于结冷胶与同类的产品相比具有用量少(0.25%的使用量就可以达到琼脂1.5%使用量的凝胶强度)，凝固点、熔点和弹性、硬度都可以调节，有很好的呈味性能，形成的凝胶有很高的透明度和强度、热稳定性好且耐酸等优良的特性，很快获得美国FDA批准用于食品工业，我国1996年也批准其作为食品添加剂使用。目前国内有关结冷胶的研究机构有华南理工大学[5]、无锡轻工业大学[6]等，但真正大量投人生产的只有美国Kelco公司。目前浙江天伟生化工程有限公司业已开始从事结冷胶的发酵生产和销售。
1结冷胶的结构和特性
    结冷胶是组成与结构类似的8种微生物多糖之一，这8种多糖分别为:结冷胶、S-60、沃仑胶、鼠李胶、S-657, S-198、Nw一11、 PS-P4，它们都具有相同的主链结构，所不同的是它们的侧链基团的数目和位置及是否含有乙酰基。在这8种结冷胶类多糖(gellan-relatedpolysaccharide或sphingan)的主链上都具有相同的四糖重复单元，依次为D-葡萄糖，D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖及L-鼠李糖(或甘露聚糖)。其中结冷胶产品有两种存在形式:一种是天然的结冷胶(也称高酰基结冷胶)，另一种是低酰基结冷胶(也称脱酰基结冷胶)。它们的主体分子结构是相同的，都是上述四糖重复单元构成的高分子糖类化合物，相对分子质量约为5 x 105。天然结冷胶与脱酰基结冷胶在结构上的主要区别在于:天然结冷胶的每个重复单元平均有一1个酰基连接在葡萄糖分子上，其酰基分为两类:一类是以β-1,3键连接在葡萄糖分子的第6个碳原子上的乙酰基;另一类是以β-1,3连接在葡萄糖分子的第2个碳原子上的甘油基，其中甘油基平均比例是乙酰基的2倍。
    天然结冷胶的主链上因为连接有酰基，使它形成的凝胶柔软，富有弹性而且粘着力强，与黄原胶和刺槐显胶的性能相似，低酰基结冷胶(天然结冷胶在pH10或更高情况下加热处理获得的产品)分子结构中的酰基全部或部分被去除，使得分子间空间阻碍作用明显减弱，形成凝胶的能力增强，因此，具有强度大、易脆裂的特点，与卡拉胶、琼胶的凝胶特性相似，在工业上一般采用低酰基结冷胶。
    结冷胶主要用作胶凝剂，它的浓度在0.05%一0.4%就能形成胶体，节约了它在食品和其他行业中的添加量。结冷胶能溶于水，但低酰基结冷胶形成凝胶须有两个条件:一是需要加热;二是要有一定量的阳离子存在，这样结冷胶溶液在加热冷却后才会形成热可逆型凝胶。凝胶的强度、凝胶形成温度及融化温度与离子浓度及种类密切相关。结冷胶对于钙、镁离子特别敏感，用钙、镁二价离子做离子源形成凝胶要比用钾、钠等一价离子有效得多，达到同样的凝胶强度，所需的钙、镁离子浓度只是钠、钾离子浓度的1/25。结冷胶的胶化过程还受许多其它因素的影响，如:多糖的浓度(随结冷胶浓度的增加结合区域的稳定性增强)、多糖的分子量、分子的酰化及温度。结冷胶具有显著的温度滞后性，其凝胶温度介干(20一50)℃之间，而凝胶融化温度介于(65一120)℃之间，这种温度滞后性对食品工业具有重要的实用意义。结冷胶的应用pH范围广，在3.5一8.0之间稳定，对大多数食品(pH介于4.0一8.0 )适用。研究者将各种酶(包括果胶酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶等)添加到结冷胶溶液中，发现酶对结冷胶溶液的粘度及凝胶强度无影响，而且结冷胶的胶体具有非常良好的透明性及牢固性，可代替琼脂作为微生物培养基的胶凝剂[9]。结冷胶也适合与其它胶体联合使用于食品加工，赋予产品有独特的口感和风味，其使用前景非常广阔[8]。
2  结冷胶的发酵生产、分离纯化和检测
2.1结冷胶的发酵生产
    结冷胶的产生菌少动鞘脂单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis ATCC 31461)，过去曾称伊乐假单胞菌(Pseudomonas eloder ATCC 31461)，是从植物体中分离获得的一种好氧的革兰阴性菌。能在以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等糖类作碳源，含无机或有机氮源及磷酸盐和微量元素的培养基中生长，其最适培养温度为30℃。
    国外众多学者对结冷胶的产生菌种、生产培养基、发酵条件等做了大量的研究，其目的是为了提高菌株的生产结冷胶的性能，降低生产成本，扩大结冷胶在工业上的应用。
    West等分离出了S. paucimobilis ATCC 31 461一个抗氨节的突变株，通过与原菌株比较，生产结冷胶的水平要比原菌株高大约1.4倍以上。彭志英等[5]分离获得一株少动鞘脂单胞菌SI，并优化了该菌产胞外多糖的工艺条件。
    Nampoothiri等[11]发现S. paucimobilis在PYG培养基中生长良好。Fialho等[12]比较了葡萄糖、乳糖和新鲜的干酪乳清等碳源对S.paucimobilis ATCC 31461发酵生产结冷胶的影响，发现最佳的碳源为葡萄糖，葡萄糖和乳糖合成的聚合物的乙酰化程度不同。Nampoothiri等[11]也研究了不同的碳源对该菌株的影响，得出最佳的碳源为2%可溶性淀粉，其结冷胶的产量达到了24.32g/L。Kanar等[13]对生产结冷胶的碳源也进行了研究，发现该菌最易利用的碳源为3%葡萄糖、4%蔗糖、3%可溶性淀粉，但葡萄糖的浓度不能大于3%，否则会抑制结冷胶的合成，若葡萄糖分2次添加时，结冷胶的产量由原来的6.0 g/L提高到8.12g/L。
    氮源也影响着微生物的生长和结冷胶的合成。S.paucimobilis ATCC 31461发酵生产结冷胶常用的氮源为NH4NO3;，而West等[14]通过实验发现用大豆油胨、玉米浆或玉米粉、蛋白胨等有机氮源代替培养基中的NH4N03;，都能使结冷胶的产量提高，其中以大豆油胨为最好，在此基础上West等[15]发现以大豆油胨为氮源的培养基增补0.1%的酵母膏，能提高结冷胶的产量。Jin等[16]研究发现，NH4N03会抑止结冷胶的合成，用廉价的豆油代替昂贵的蛋白胨为氮源时，在没有NH4NO3存在下的产量提高了3倍。Nampoothiri等[11]研究了酵母膏、蛋白胨和各种无机氮源对结冷胶生产的影响，发现最佳氮源为蛋白陈，其产量为32.1g/L，同时还发现添加0.5%苏氨酸能提高结冷胶产量。
    种龄和接种量对微生物发酵有很大的影响，它不仅影响微生物的生长量，而且影响产物的合成，因而，种龄和接种量的控制非常重要。Nampoothiri等[11]等发现S.paucimobilis ATCC 31461的最适种龄和接种量分别为20h和10%。而Kanari等[13]发现Pseudomonas eloder最适的种龄和接种量分别为16h和8%.
    温度是影响微生物生长和产物合成的一个重要因素。West[17]研究了温度对S.paucimobilis ATCC31461发酵生产结冷胶的影响，结果表明，结冷胶发酵的最适温度为(30一31)℃，若温度下降到28℃或升高到33℃时，结冷胶的产量与最适温度下的产量相比大约卜降50%，而菌体生长的最适温度为31℃.
    培养基初始pH值也是微生物发酵生产的一个重要的控制条件。West等[18]，研究发现S. paucimobilis(ATCC 31461)发酵生产结冷胶最佳的pH值在6.8一7.4之间。Nampoothiri等[11]研究也得出与此相似的结果。
2.2结冷胶的分离纯化和检刚方法
    结冷胶的生产是高黏性代谢产物的微生物发酵过程，胞外多糖围绕细胞以黏性聚合物形式形成网状结构，因此，难以将胞外多糖与细胞分离，即使在大量稀释后也难以分离出来[1]。
    提取多糖的一般方法是将发酵液稀释若干倍以降低其黏性，然后通过离心分离菌体和多糖，异丙醇和乙醇常用来沉淀多糖。大多数研究者多通过冷冻干燥、超速离心和超滤来浓缩结冷胶。文献报道称在(80 -- 90)℃高温下加热发酵液，然后用异丙醇或乙醇沉淀可以增加多糖的提取率[1]。
    常用的醇沉淀得到粗的脱乙酰结冷胶的工艺为将发酵液于沸水浴中保持15 min，冷却后用1 mol/LNaOH调节pH至10后于80℃保持10 min，然后用1mol/L HCl调节至中性，把以上处理了的发酵液于4℃，8000 r/min离心30 min除去菌体，取上清液若干用2一3倍体积的异内醇(或乙醇)沉淀，4℃过夜后又于4 0C , 8000 r/min离心30 min得沉淀，沉淀物于80℃烘干后称重[19]。要提高结冷胶的纯度，通常通过异丙醇、丙酮、四氢呋喃等溶剂多次沉淀和多次在水中溶解来纯化多糖[1]。
    发酵过程中结冷胶的定量检测方法不多，最常用的方法是醇沉淀得到的沉淀物烘干后称重，是最直观的方一法。West等[20]利用一种比色法对结冷胶进行定量检测，经实验发现，该方法在结冷胶浓度为0 ~0.7g/L之间呈现良好的线性关系。食品中结冷胶的检测方法采用一系列的沉淀反应和比色反应，它是以测定鼠李糖(结冷胶的成分之一)的方法作为基准，但是这种方法要经过一系列的反应步骤，误差很大，而且当食物中含有低浓度的结冷胶时，这种方法就检测不到。有新的研究报道，利用毛细管电泳一质谱仪((CE-MS)测定食品中的结冷胶。根据结冷胶的分子结构，可以看出这种结构的多聚物应具有统一的质荷比。这种情况下，CE就是最好的将结冷胶从具有复杂结构的食物中分离出来的检测仪器。此方法已成功用于检测一些含有微量结冷胶的水果风味的饮料[21]。也有研究报道，利用气相色谱法作为检测食品中结冷胶成分的方法，食品溶解及水解后将2一脱氧葡萄糖作为内标物，根据检测器所得色谱图来推测在食品中是否含有结冷胶[12]。
3  结冷胶的生物合成途径和代谢遗传改造
    结冷胶多糖是在细胞内合成的，然后通过载体脂蛋白作用穿过细胞壁或细胞膜而分泌到细胞外。结冷胶生物合成的途径，目前还没有形成完整的理论，但Ligio等[22,23]提出了由S.paucimobilis ATCC31461合成结冷胶的可能途径，其合成体系包含5个因子，即糖基一核营酸、酰基供体、脂中间体、酶系统及糖基受体，提供糖基一核苷酸的活性前体假定为UDP-葡萄糖、TDP-鼠李糖和UDP-葡萄糖醛酸，作为重复四糖单位合成结冷胶的单体供体(见图1)。涉及前体合成的酶有磷酸葡萄糖异构酶(PGI )、磷酸葡萄糖变位酶(PGM), UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP )、TDP-葡萄糖焦磷酸化酶(TGP )、UDP-葡萄糖脱氢酶(UGD)和TDP一鼠李糖合成酶(TRS)。

    Correia等[24]认为在结冷胶生物合成途径的所有酶中，PGM起着最关键的作用，同时他认为，除了PGI, PGM, UGP, TGP等酶是胞内基因单独编码的酶外，还有一个包含着编码TRS、控制胶的四聚体聚合、转运、输出到胞外的一个基因簇，称为gelcluster。有利于EPS合成的条件是增加前体合成酶的水平，尽管这些酶的水平与结冷胶产量相关，但其他前体合成下游的相关催化步骤的酶的作用也不容忽视，尤其是gel cluster相关基因编码的酶。
    因为结冷胶类多糖具有重要的应用前景，一些研究者对其产生鞘脂单胞菌的生物合成途径以及代谢途径进行了研究，期望提高产量和改善产品质量。Thorne等[25]发现用多拷贝质粒扩增鞘脂单胞菌S7染色体上的PGM基因和合成多聚体的sp，基因簇后，PGM的酶活增加了6倍，多糖的产量和发酵液的黏度增加20%以上。Videira等[26]对S.paucimobilis ATCC31461的代谢途径进行研究时发现，该菌株的PGM基因克隆并被表达在大肠杆菌中的表达产物具有2种酶(磷酸葡萄糖变位酶和磷酸甘露糖变位酶)的活性，与鞘脂单胞菌S7的PGM相比，同源性达到83% ,并对该酶的其他生化特征进行了鉴定和比较，他们[27]，还对合成途径中的gel cluster的1个gel K基因进行了研究，该基因编码的产物能够催化UDP-葡萄糖醛酸连接到与脂连接的葡萄糖上。Marque、等[28]还克隆并表达了S.paucimobilis ATCC 31461的编码UGP的基因，得到UGP的融合蛋白，并对得出的生化酶学参数进行了比较。Silva[29]等在Marques等研究的基础上对TDP一鼠李糖合成途径中的一个关键基因rmlA和编码UGP的基因ugpG进行了研究，结果发现，2个基因编码的蛋白产物都具有UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)和TDP-葡萄糖焦磷酸化酶(TGP)的活性。
    虽然目前对微生物多糖的分子生物学研究的还不是特别多，但随着分子生物学技术的发展以及代谢工程的进展，对结冷胶生产菌的生物合成和代谢的遗传改造将是今后研究的重要目标。
4结冷胶的应用与展望
    结冷胶作为一种新型的微生物胞外多糖，用途非常广泛。在食品领域主要用做增稠剂、凝结剂、悬浮剂和成膜剂等，作为一种新型的食品添加剂与其他同类产品相比具有用量少、性能更加稳定、凝结度高，凝胶清亮和优良的呈味性能，其在pH值为3.8一8.0之间具有极好的稳定性，在温度高达100℃以上的高温条件下仍然保持着良好的物理状态。在肉制品和蔬菜类制品的加工过程中添加结冷胶后会使产品具有清爽的口味，起到弥补产品品味不足的良好作用。鉴于上述优点，结冷胶逐步成为继卡拉胶、琼脂和黄原胶之后的最理想的添加剂。结冷胶除在食品上广泛应用外，还可应用于其他领域。如在医药上可用作眼药水，软、硬胶囊，包衣剂及新型制剂用药水等;在化工上可用做涂膜、胶粘剂、牙膏等;农业上可用作叶肥、缓释肥料等;它还可以作为琼脂的替代品制备生物培养基，特别是可用于澄清度要求高的培养基，如嗜温微生物的培养基[30]，它还是植物组织培养的良好培养基。Shigeta等[31]通过实验研究发现，用结冷胶取代植物组织培养基中的琼脂能取得更好的效果。结冷胶在其他方面的应用也很广，包括作为人体组织材料、感光薄膜、房间清香剂、包裹热敏感材料(例如酶与细胞、脱氧核糖核酸电泳与分离的可逆凝胶等)以及用于胶片、胶卷、纤维、个人护理用品等。
    结冷胶作为一种很有发展前途的微生物多糖，近年来，它的年增长量均在30%以上，由于其生产原料(如蔗糖)价廉、易得，而自身的价格却高达34美元/kg，有极高的商业利润和市场前景[19]。由于结冷胶的发酵，发酵液的黏性是影响发酵最重要的因素，因而需要进行很多结冷胶发酵方面的研究以解决因高黏性而引起的传质方面的障碍。同时，改进现有的分离过程或寻找新的结冷胶分离方法，也是很重要的研究内容，并且应考虑其分离、发酵工艺同步进行的工艺可行性和经济性。
    由于分子生物学技术的发展，我们应着手从生物技术的角度，通过先进的物理、化学诱变、细胞融合、基因克隆、PCR等技术和手段对产胶微生物的代谢途径进行遗传改造，从而得到高产高性能菌株，也可以将产胶基因转移到厌气性微生物中正常表达，在无氧或微氧条件下生产结冷胶以降低成本，使结冷胶的生产及应用有着很好的前景。