灵芝深层液体发酵多糖的提取与测定
2006-09-17 16:56:20   来源：不详   评论：0 点击：

0 前言
      灵芝是我国传统的名贵药材，富含丰富的营养，具有保健作用。灵芝多糖是其中的最有效成分之→，它能加快血液循环，提高血液供氧能力，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA、RNA和蛋白质的能力，具有防治肿瘤等作用，市场需求量越来越大。→般灵芝多糖几乎都是从子实体中提取， 由于灵芝野生资源贫乏， 人工栽培周期长(2～3个月以上)，占地面积大，又受季节限制，从而影响了灵芝的充分利用；而采用深层发酵技术生产灵芝周期短(7～10d左右)，成本低，产量大，具有工业化生产前景。本文对灵芝深层液体发酵多糖的提取及分析进行初步研究，现将实验结果报道如下。
1 材料与方法
1．1 灵芝深层发酵多糖的提取
1．1．1 菌种与试剂
      菌种：红灵芝由上海市食用菌研究所提供；
      种子培养基：马铃薯20％ 、蔗糖2％ 、磷酸二氢钾、0．3％ 、MgS04·7H20 0．15％ 、pH值5．5；发酵培养基：玉米粉1％ 、葡萄糖2％ 、酵母膏0．5％ 、KH2P04·3H20 0．15％ 、MgS04·7H20 0.15％ ：
      种子培养条件：250mL三角瓶培养液70mL，旋转式的摇床(165r／min)，28~C条件下培养7d。
1．1．2 发酵工艺 斜面菌体→→级种子培养(250mL三角瓶装液70mL、摇床转速150r／min、28~C培养3d)→二级种子培养(500mL三角瓶装液100mL、摇床转速150r／min、28~C培养3d)→转入10L大罐中深层发酵(装料系数50％ 、接种量10％ 、搅拌速度150r／min，通气量1L／min、28~发酵144h)。
1．1．3 发酵上清液胞外多糖的提取
      发酵液离心→发酵上清液浓缩→浓缩液透→透析液浓缩→浓缩液离心→上清液乙醇沉淀→沉淀物干燥→外多糖。
1．1．4 菌丝体胞内多糖的提取
      发酵液离心→菌丝体干燥→菌丝体干粉抽提→提取液浓缩→浓缩液离心→上清液醇析→沉淀物干燥→胞内多糖。
1．1．5 粗多糖的纯化
      粗多糖经sephadexA-25柱层析、NaCI梯度洗脱→含糖部分、经sephadexG-200柱层析、0．1mol／L NaC1洗脱→多糖纯品。
1．2 灵芝液体发酵多糖的测定
1．2．1 多糖的纯度鉴定
      采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶进行纯度检验
1．2．2 多糖含量的测定-苯酚一硫酸法
      苯酚一硫酸试剂可与游离寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，生成有色化合物的吸光度与糖含量呈线性关系。
      试剂： 浓硫酸： 分析纯，96．5％ ；80％ 苯酚：80g苯酚加20mL水使之溶解置于冰箱中避光长期保存。以分析纯葡萄糖为标准。
2 灵芝液体发酵多糖的测定
2．1 灵芝液体发酵多糖测定条件的探讨
2．1．1 最佳波长的选择
      选择好参比液，在溶液浓度和液层厚度一定的条件下，改变入射光波长，测定其吸光度，结果如图1。

          
2. 1. 2 显色时间的选择
      选择好参比液，在其他条件已知的情况下，改变显色时间，测定吸光度，结果如图2所示：

          
2．1．3 选择好参比液，在其它条件下一定的情况下，改变显色温度。结果见图3。

           
2，1．4 结论
      以苯酚一硫酸法测定发酵液中多糖含量最佳条件是：波长为497nm，显色时间为20min，显色温度30℃ 。
2．2 多糖的测定
      发酵液中多糖的测定，结果如表1。

            
        灵芝子实体多糖的测定，结果如表2。

       从以上结果看出：从菌丝体中提取的多糖与子实体中的多糖有相同的数量级，约为干重的0．5％ ～2．5％之间，同时上清液中还含有丰富的胞外多糖，若以每升发酵液的菌丝干重15．1计，则发酵液所含的多糖总量为3．48g／lOOg干菌体，略多于100g子实体中提取的冷水溶多糖，这说明以发酵方法制取灵芝多糖是很可取的。