红曲霉菌固体发酵产Monaclin K工艺的优化
2007-09-24 09:54:14   来源：微生物学杂志   评论：0 点击：

红曲霉的利用在我国具有悠久的历史，红曲霉在生长过程中可以产生色素、抑菌物质、酶类、胆固醇生物合成抑制剂等多种代谢产物。但液体深层发酵生产红曲色素的工艺设备投资大，生产成本高，且规模较小，而固态发酵优势明显。因为固态发酵所得全部发酵物均可入药，这样不仅可以省去提取过程，并且发酵物中含有的其他有益组分协同作用更有助于全面治疗，也可以制成各种营养保健食品，方法简单，产品商业效益高。因而本文研究拟采用红曲霉固态发酵工艺，通过实验优化工艺条件，提高色价及MonaclinK产量。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
红曲霉菌株Monacus-3，由作者所在实验室自行筛选并保存。

1.1.2培养基

斜面培养基：麦芽汁10°Bx，琼脂2%。
孢子培养基：小米25 g，水30 mL，装入1000 mL三角瓶，121℃下灭菌60 min。
固体发酵培养基：市售大米经清洗，在碳、氮源溶液中浸泡24 h后，沥干，121℃灭菌。在发酵过程中，调整附加碳、氮源和其他成分的种类和比例。
1.1.3主要试剂
大麦芽、琼脂、葡萄糖、果糖、甘油、酵母膏、CO(NH4)2、NaNO3、NH4Cl、MgSO4·7H2O、KH2PO4、
ZnSO4·7H2O、MnSO4·2H2O、乙醇、乙酸乙酯、NaCl等均从市场购买。
1.1.4主要仪器
无菌操作台、恒温恒湿化培养箱、摇瓶机、灭菌机、糖度计、接种铲、分析天平、生物显微镜、723分光光度计、高效液相色谱仪、数字酸度计、离心机、热风干燥箱、玻璃仪器若干种。
1.2方法
1.2.1培养方法
小米孢子培养：取活化后的斜面菌种接入孢子培养基中，32℃培养7~11 d。
固体发酵：500 mL三角瓶装约20 g大米，每瓶接种适量小米孢子，32℃培养，相对湿度为50%。不同实验因素根据设计实施。
1.2.2 Monacolin K含量的测定
采用美国Waters公司HPLC仪，色谱柱：phenomenexC18，5μm，250 mm×4.6 mm；流动相：甲醇：0.18%磷酸＝80:20，流速：0.8 mL/min，紫外检测237 nm；进样体积20μL；柱温为35℃，样品经0.45μm滤膜过滤后用HPLC法测定Monacolin K含量，外标法。
2结果与分析
2.1初始含水量对Monacolin K产量的影响物料的初始含水量是影响固体发酵的主要因素之一。基质含水量同氧向空隙的转移紧密相关。因为过多的游离水将充满空隙，挤走空气，妨碍空气流动。低含水量使基质膨胀程度低，水张力高，生长受抑制。如表1，考察起始含水量（相当于大米质量）为20%，30%，40%，50%，60%和70%对Monacolin K产量的影响。发酵15 d后测定各样品中Monacolin K的含量。
从表1可知，含水量为30%左右时，物料干硬，菌体难以生长，产量低，如果发酵过程中不补充水分，发酵产物中几乎检测不到Monacolin K；含水量为70%时，发酵第1，2 d时菌体长势较好，之后，物料开始结团，底部出现红色粘稠液体，发酵产物中Monacolin K含量极微；而含水量为50%时，发酵过程较平稳，不但利于菌体的生长而且Monacolin K产量高。故固体发酵起始含水量以50%最为合适，这与产红曲色素的最适含水量相同。

2.2培养时间对Monacolin K产量的影响
加20 g大米于250 mL三角瓶中，起始含水量为50%，进行红曲霉固体发酵。每天取样测定MonacolinK的含量。

如表2所示，固体培养7 d后，Monacolin K产量开始增加，从第10 d开始增加迅速，一直到13 d，之后增长变慢，到第16 d，Monacolin K含量有下降的趋势。实验还发现，培养到第4 d，大多数米粒开始呈微红，且粘附在瓶壁上的米粒边缘可看见红色菌丝。从Monacolin K的积累量来看，固体发酵的周期以15d为宜。
2.3温度对Monacolin K产量的影响
温度对红曲霉产Monacolin K很敏感，23℃~32℃的范围内，Monacolin K产量随着温度升高而急剧降低。在32℃，Monacolin K产量非常低，23℃~25℃最为合适。但在发酵前7 d，23℃~25℃不适合菌体生长，因此采用变温培养，即：32℃~35℃培养7 d后，降温至23℃~25℃培养至15 d。
2.4初始pH值对Monacolin K产量的影响
分别调整起始pH值至2.5，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0按上述条件进行固体发酵培养，测定Monacolin K产量，结果见表3。从表3知起始pH值在3~6时对Monacolin K产量影响不大，所以试验中可选用自然pH。这与红曲固态发酵产色素对pH的要求相同。

2.5辅加碳源对Monacolin K产量的影响
分别添加0.2%的甘油、5%葡萄糖、5%麦芽糖及5%蔗糖为附加碳源，比较不同附加碳源对Monacolin K产量的影响，结果见表4。

由表4可知，这几种附加碳源的加入都有利于Monacolin K的积累，其中以0.2%的甘油和5%葡萄糖为附加碳源时，Monacolin K产量都较高，而甘油做附加碳源时，产量最高，故选择甘油为适宜的附加碳源。葡萄糖做附加碳源使得在菌体生长初期容易被利用，因而菌体生长较好。
2.6氮源对Monacolin K产量的影响
选取各种氮源进行比较，结果见表5。

实验表明，在所选择的附加氮源中，以有机氮源蛋白胨和无机氮源NaNO3较好。其中加入蛋白胨，Monacolin K产量可达0.879 mg/g；加入0.2%的NaNO3，Monacolin K产量可达0.792 mg/g。因此，我们选用蛋白胨作为附加氮源。
2.7培养基配比的正交试验结果与讨论由单因子试验可知，以质量分数为0.2%的甘油、5%的蛋白胨和50%的起始含水量为最好。在单因子试验的基础上，选择了甘油、蛋白胨和起始含水量3个影响因素，在培养条件为：250 mL三角瓶中加20 g大米、pH自然偏酸、培养15 d的基础上作三因素四水平的正交试验，以确立培养基中各组分的质量分数及其配比。结果见表6。

表6的正交试验结果表明，影响因子C>A>B，即起始含水量的影响最大，这更加说明了固体发酵中起始含水量是最关键的影响因素。最佳培养基配方为A3B4C2，即甘油和蛋白胨的质量分数以0.2%和0.7%最好，起始含水量50%最好。根据以上分析，最佳的发酵培养基配方为：250 mL三角瓶中装20 g大米，甘油质量分数0.2%、蛋白胨质量分数0.7%，起始含水量50%。
3结论
最佳发酵培养基配方：250 mL三角瓶中装20 g大米，发酵时间15 d，采取变温培养，即32℃~35℃培养7 d后降至23℃~25℃培养到15 d，pH自然，麦芽汁斜面直接接种，甘油0.2%，蛋白胨0.7%，起始含水量50%，并保持在46%~52%。采用优化工艺配方，结合最佳的培养条件，重复3次实验，结果表明，Monacolin K产量稳定在1.8 mg/g左右，最高产量为2.1 mg/g干固物。建议进行中试以及工业化生产的实验时，适当调整发酵工艺以适应新条件，最终达到或超过实验室水平。同时可探索在线检测生物体生长，监控基质含水量工艺，实现传统固态发酵现代化。