茯苓菌液体培养条件的优化及其多糖的提取
2007-04-07 23:53:41   来源：工业微生物   评论：0 点击：

　　茯苓属担子菌亚门,多孔菌科,卧孔菌属,是珍贵的药食两用菌,具有益脾、促胃、祛湿、安神、生津等功能[1]。近年来研究显示茯苓中的多糖或异多糖具有促进细胞分裂、抗诱变、抗肿瘤、增强免疫等活性而倍受关注[2],其开发价值及应用前景巨大。目前茯苓菌为野生或人工种植,周期长,受产地限制,难以获得标准一致茯苓菌以满足工业化。而液体发酵具有易于操作、易于工业生产、易于提高产率的优点,已逐渐成为真菌生物活性物质开发的方向,国内的研究尚处于刚起步阶段[3、4]。本文对激光诱变所获得的速生高产突变株Ｆ2.10的培养条件及培养基中碳、氮源的种类和浓度进行了优化,探求批量获得茯苓菌的方法,并对其中的多糖进行了提取和分析。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌株　　茯苓Ｆ2.10(Ｐｏｒｉａｃｏｃｏｓ Ｆ2.10)为本实验室经激光诱变所获得的速生高产突变株。1.1.2　主要仪器　　ＢＳ ＩＥＡ振荡培养箱。

1.1.3　培养基　　(1)活化培养基:土豆20%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,琼脂2%,ｐＨ自然。

　　(2)液体培养基(%):葡萄糖3ｇ,蛋白胨1ｇ,ＫＨ2ＰＯ40.1ｇ,ＭｇＳＯ40.05ｇ,ＣａＣｌ28ｍｇ,ＭｎＳＯ46ｍｇ,ＶＢ10.03ｍｇ,柠檬酸铁铵0.5ｍｇ,蒸汽灭菌20ｍｉｎ(ＶＢ1另行灭菌)。

1.2　实验方法

1.2.1　活化与培养

1.2.1.1　斜面培养　　活化培养基接种两环原菌种于26℃培养一周后,放冰箱内保存待用。

1.2.1.2　摇瓶发酵　　接种0.5ｃｍ2方块3块茯苓菌丝于一定体积的液体培养基中(250ｍＬ三角烧瓶),在一定温度和一定转速下摇瓶培养。

1.2.2　培养条件的优化　　摇瓶转速对茯苓菌生物量的影响:将盛有100ｍＬ液体培养基的250ｍＬ三角瓶分别置于不同转速下26℃进行摇瓶培养5ｄ。　　摇瓶装液量、起始ｐＨ值、培养温度、培养时间对茯苓菌生物量的影响:采用Ｌ16(44)正交试验进行优化。

1.2.3　碳、氮源的优化　　配制摇瓶培养基时,加入不同碳源及氮源,观察茯苓菌生长情况,选取最佳碳、氮源,并进行碳、氮源浓度优化。

1.2.4　生物量的测定　　培养液用80目铜筛过滤,收集菌丝体用蒸馏水洗涤3次,4000ｒ ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,得菌丝体于45℃真空干燥得菌丝干重。

1.2.5　茯苓多糖的提取　　菌丝体的预处理:30ｇ菌丝体分别用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取6ｈ,去脂肪,凉干备用。　　水提法:处理后的茯苓粉末加5倍量的水,沸水提取1.5ｈ,离心得上清液。沉淀继续水提一次,离心,合并两次上清液减压浓缩至1 5,加入3倍无水乙醇,于4℃冰箱内静置过夜,沉淀物于半透膜透析过夜,真空干燥得水溶性粗多糖。　　碱提法:上述滤渣用5倍量0.5ｍｏｌ Ｌ的ＮａＯＨ浸提过夜,离心得上清液,沉淀继续用0.5ｍｏｌ ＬＮａＯＨ浸提过夜,合并两次上清液,用乙酸调ｐＨ至中性,减压浓缩至1 5,浓缩液中加入3倍量的无水乙醇于4℃冰箱内静置过夜,沉淀物于半透膜透析过夜,真空干燥得碱溶性粗多糖。

1.2.6　茯苓多糖的测定　　苯酚 硫酸法[5]。

1.2.7　茯苓多糖的红外光谱(ＩＲ)分析　　试样经ＫＢｒ压片后采用ＷＱＦ 200ＦＴ ＩＲ光谱仪测定其红外光谱,波长范围为4000～500ｃｍ-1。2　结果与讨论2.1　摇瓶转速对茯苓菌生物量的影响　　转速是影响摇瓶发酵供氧的主要因素,分别选择不同转速以考察其对茯苓生物量的影响,结果见图1。由图1可知,转速150ｒ ｍｉｎ时生物量最高,为1.384ｇ 100ｍＬ,在120～150ｒ ｍｉｎ均可获得较高的生物量。

2.2　摇瓶装液量、起始ｐＨ、培养温度、培养时间对茯苓菌生物量的影响　　采用Ｌ16(44)正交设计考察这些因素对茯苓菌生物量的影响,实验安排及结果如表1。

　　由结果可看出,因素对生物量的影响程度从大到小分别为培养液起始ｐＨ、摇瓶装量、培养温度和培养时间,得出最佳培养条件为:培养液起始ｐＨ5.5、摇瓶装量80ｍＬ、温度26℃、培养时间5ｄ,在此条件下摇瓶培养,100ｍＬ培养液可获得1.562ｇ干菌丝体。2.3　碳源对茯苓菌生物量的影响　　碳源是构成菌体成分的物质基础,同时也为微生物的生长提供主要能源。分别以3%的ａ:葡萄糖、ｂ:蔗糖、ｃ:玉米粉水解液、ｄ:麦芽糖、ｅ:乳糖、ｆ:玉米糖浆、ｇ:淀粉作为碳源,以考察茯苓利用不同碳源的能力。由图2结果知蔗糖最能促进Ｆ2.10的生长,其次为葡萄糖、玉米粉水解液和麦芽糖,而对淀粉的利用能力最差。故确定蔗糖为最佳碳源,并进一步考察其浓度对生物量的影响,结果如图3所示。可看出低浓度时随着浓度的增加生物量有较大增长,当浓度达4%后,随着浓度的增加生物量增长却很有限,且浓度达7%时生物量反而降低,可能是较大的糖浓度会造成抑制作用,同时也阻碍空气中氧的溶解,不利于沉没菌丝体的生长[6]。确定4%蔗糖为碳源浓度。

2.4　氮源对茯苓菌生物量的影响　　氮源是组成蛋白质、酶和核酸的主要元素,微生物对不同的氮源具有不同的利用能力,适宜的氮源将促进微生物的生长。分别以ａ:0.5%蛋白胨+0.5%牛肉膏、ｂ:0.5%蛋白胨+0.5%酵母膏、ｃ:0.5%牛肉膏+0.5%酵母膏、ｄ:1.0%蛋白胨、ｅ:1.0%酵母膏、ｆ:1.0%牛肉膏、ｇ:2%豆饼粉、ｈ:0.5%硫酸铵、ｉ:0.5%尿素为摇瓶培养基的氮源,考察Ｆ2.10利用不同氮源的能力。由图4知豆饼粉最有利于茯苓菌的生长,确定为最佳生长氮源,并进一步考察其浓度对生物量的影响,结果如图5所示。可看出3%豆饼粉浓度可获得较高生物量,为2.21ｇ 100ｍＬ,浓度的进一步增加生物量增长有限,且浓度达6%以后生物量反而降低,故以3%为最佳浓度。2.5　茯苓多糖的提取　　采用水煮和稀碱浸提法对30ｇ干菌丝体进行提取分别得1.38ｇ水溶性茯苓粗多糖和19.75ｇ碱溶性茯苓粗多糖,其中多糖含量分别为90.54%和88.42%。图6为它们的红外光谱图。由图可知它们在3300～3600ｃｍ-1有羟基(-ＯＨ)的强烈缔合峰,2920ｃｍ-1附近的峰是糖类Ｃ Ｈ的伸缩振动,1400～1200ｃｍ-1附近的峰是糖类Ｃ Ｈ的变角振动,1200～1000ｃｍ-1为环上Ｃ ＯＨ的吸收峰,在890ｃｍ-1附近有明显的β Ｄ 葡聚糖特征吸收峰[7]。ＩＲ表明,提取的两多糖的主要成分为β Ｄ 葡聚糖。

3　结论　　茯苓菌株Ｆ2.10液体摇瓶培养的最佳条件为:起始ｐＨ5.5、培养温度26℃、摇瓶转速150ｒ ｍｉｎ、摇瓶装量80ｍＬ 250ｍＬ三角瓶、培养时间5ｄ;摇瓶培养基最佳的碳、氮源分别为蔗糖和豆饼粉,最适浓度分别为4%和3%。在上述条件下100ｍＬ培养液可获得2.21ｇ干重生物量。用水煮和稀碱浸提法可从30ｇ干菌丝体中分别获得1.38ｇ水溶性粗多糖和19.75ｇ碱溶性粗多糖,经测定多糖含量分别为90.54%和88.42%。ＩＲ分析结果表明这两种多糖的主要成分为β Ｄ 葡聚糖。