PriCells-磁珠法分离小鼠T细胞和B细胞
2010-06-27 17:32:22   来源:不详   评论:0 点击:

 
PriCells: 磁珠法分离小鼠T细胞和B细胞
 
基本方案
用AUTOMACS系统进行总T细胞、CD4+细胞或CD8+T细胞的自动分离
 
实验材料
1、小鼠
2、HBSS洗涤缓冲液
3、MACS缓冲液
4、磁珠
5、RPMI-10完全培养基
6、AUTOMACS系统和分选柱
7、30μm尼龙网或40μm预分离滤膜
 
实验方法
1、用5只小鼠的淋巴结或2只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞。
 
2、细胞在10mlHBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。
 
3、细胞悬液在4℃,200g离心10min。弃上清后将沉淀按每108个细胞0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每108个细胞加入0.1ml适当的磁珠后在4℃孵育15min。
 
4、在孵育的时间里,打开AUTOMACS系统电源。按产品说明书中操作规程运行清洁程序。
 
5、细胞悬液在4℃,200g离心10min。弃上清,在沉淀中加入足量的MACS缓冲液使细胞浓度达到108个细胞/ml,充分混悬。将细胞通过30μm尼龙网或40μm预分离滤膜。用0.1~0.4mlMACS缓冲液冲洗滤网。
 
6、细胞放到AUTOMACS的上样通道。选择possel程序,这样标记的细胞将从阳性通道洗脱。
 
7、细胞悬液在4℃,200g离心10min。弃上清后将沉淀用2~5ml RPMI-10完全培养基混悬。计数。
 
附录:
RPMI完全培养基:
       RPMI1640培养基含有:
       2%、5%、10%、15%或20%FBS,56℃热灭活1h
       2μmmol/L L-谷氨酰胺
       50μmol/ml 2-ME
       100U/ml 青霉素
       100μg/ml 硫酸链霉素
 
RPMI-10完全培养基:
       配制RPMI完全培养基加入:
       10%(V/V)FBS
       1mmol/L 丙酮酸钠
       50μg/ml庆大霉素
       10mmol/L HEPES
       4℃可保存2周
       过滤除菌
 
HBSS洗涤缓冲液:
       HBSS,含有:
       5%(V/V)FBS
       20mmol/L HEPES,pH7.0
       100U/ml 青霉素
       100μg/ml 链霉素
       4℃可保存1个月
 
MACS缓冲液:
       PBS,pH7.2
       0.5%(m/V)BSA
       2mmol/L EDTA
       过滤除菌
       用于自动MACS系统,室温储存1个月
       用于LS或LD柱时,脱气,4℃保存


来源:武汉原生原代生物医药科技有限公司
联系电话:027-87490190/87490191
E-mail:pricellssales01@163.com
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