全自动核酸分子诊断系统的某些进展
2010-05-26 22:36:06   来源：不详   评论：0 点击：

全自动核酸分子诊断系统的某些进展

        刘宾 覃斌兵 刘洪娜 何农跃

(东南大学生物电子学国家重点实验室 江苏南京210096)

 

摘 要 随着后基因组时代的到来，全自动核酸分子诊断系统得到了广泛的应用。本文立足于国内外医疗仪器市场全自动核酸分子诊断系统的现状，介绍了全自动核酸分子诊断系统的基本组成及其关健技术。在此基础上介绍了国际上全自动分子诊断系统的主要生产商及其产品，并对具有代表性的几个产品的特点进行了分析。最后对全自动核酸分子诊断系统的发展进行了展望。

关健词 全自动;高通量;分子诊断;单核苷酸多态性

 

Liu Bin, Qin Binbing, Liu Hongna, He Nongyue

(Southeast University, State Key Laboratory of Bioelectronics, Nanjing Jiangsu, 210096)

Abstact With the post-genome era coming, fully automated nucleic acid molecular diagnostic system has been used widely. In view of existing situation of the fully automatic nuclear acid molecular diagnostic system in medical apparatus and instument market, the principle of the fully automatic nuclear acid molecular diagnostic system is introduced.The characters of representative products are analyzed. At last, the development of fully automatic nuclear acid molecular diagnostic system is prospected.

Key words  Fully automatic; High throughput;Molecular diagnostics; SNPs

 

分子诊断是指利用核酸或蛋白质作为生物标记进行临床检测的诊断技术，为疾病的预测、诊断、预防、治疗和转归提供了信息和决策依据。特别是面对各种突发性传染性疾病，其最经济有效的措施就是快速、准确的分子诊断。分子诊断的发展很大程度上受分子诊断仪器自动化的影响。人类基因组计划的完成，日臻完首的分子诊断方法，使得分子诊断自动化得到了进一步的发展。

全自动分子诊断系统能够实现多样本，多位点的快速的高通量检测，它不仪能够将研究人员从实验台边上解放出来，满足人们对大量生命信息进行分析的要求、大大加快实验和研究进程，而且具有适合临床应用的检侧方法，因此在实验室和临床检验中得到了越来越广泛的应用。

    以基于磁分离的全自动分子诊断系统为例，其基本功能框图如图1所示。

    大多数全自动分子诊断系统包括以下几个功能模块:样本提取、样本处理、高通量样本检测与分析等。其硬件系统一般包括:精确移液模块、机械抓板臂、精确温控模块、信号检测模块等。

全自动分子诊断系统能够完成“样本制备一靶分子富集或扩增一信号检测一数据分析”的生物分子检测分析的全过程自动化。其中涉及到的关键技术包括基于功能性磁性纳米颗粒（Functional Magnetic Nanoparicles, FMNPs）的样本提取与处理技术、生物靶分子的获取与放大技术、高通量信号检测技术等。

     1997年，Hawkings等提出了基于磁性纳米颗粒分离和富集功能的DNA提取技术^[3] 。磁性纳米颗粒提取是一个简单、快速、有效的DNA分离方法，整个操作过程无需离心或柱分离。无需使用有机溶剂及其它有毒试剂，可实现高通量自动化操作，特别适用干全自动工作站。2006年，Berensmeie等将传统的 DNA提取方法和基于磁性纳米颗粒的提取方法进行了比较^[4]，指出采用磁性纳米颗粒提取模板DNA，可以去除许多影响后续聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）的杂质，提高PCR扩增的稳定性。此外，一定量的磁性纳米颗粒可以吸附一定量的DNA，有助于获得相对恒量的模板DNA。Thermo Scientific公司提出的Kingfisher专利技术通过磁棒转移磁珠从而转移样品，避免了DNA提取过程中繁琐的液体处理过程，使得平行的纯化样品的高通量化成为可能。

 PCR反应通常在均一的溶液中进行，而在纳米颗粒表面实现PCR扩增已成为目前的一个研究热点。2000年，Adessi和Huber等人提出了基于固相的PCR技术，并在此基础上研究了玻璃表面的PCR,探讨了研制相应DNA芯片的可能性^[5]；2007年，Lermo等人研究了基于磁性纳米颗粒表面的PCR，并用电化学的方法检测食物中的病原休^[6]。

     此外，已经有国外研究者利用磁性纳米颗粒进行基因突变点检测。 2003年，东京农业大学Matsunaga教授及其研究小组首先制备了亲和素修饰的细菌磁性纳米颗粒（Bacteria magnetic particles, BMP）,然后利用BMP发展了一系列的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNPs分型方法，同时还发展了一套基于96孔板的自动操作系统，但是这些检测方法相对比较耗时，且不易实现高通量化。2005年，Kakihara及其研究小组利用磁性纳米颗粒作为反应载体固定生物素标记的延伸引物，与纯化的PCR产物退火后，延伸上标记有碱性磷酸酶的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleotide triphosphate, ddNTP），最后通过化学发光方法检测SNPs^[8]。该方法能够准确对样本进行分型，但分型前首先需要进行PCR扩增和产物的纯化浓缩，操作过程相对复杂。

     2007年，刘洪娜等利用磁性纳米颗粒PCR扩增(MNPs-PCR)和等位基囚特异性双色荧光探针(Cy3，Cys)杂交技术，建立了一种单核昔酸多态性分型的新方法^[9]。此方法无须产物纯化、浓缩，扫描分型结果快速、直观，是一种操作简单、快速，高通量、高灵敏度的分型方法，而且容易实现自动化。2008年，刘洪娜等提出了一种应用磁性颗粒和通用连接子扩增技术(Adaptor-PCR)的多位点SNP分型方法^[10]。通过连接子PCR扩增样本的全基因组产物，实现了对多个样本多个SNP位点的同时检测，避免了复杂的多重引物扩增。该方法能够在短时间内完成对大量样本的多个位点分型，且分型结果直观，谁确，正错配信一号比值高(>3 .0)。

     2009年，何农跃等提出的基干磁性纳米颗粒的PCR扩增和双色荧光通用标签的高通量SNP分型技术被作为一种通用的分子生物学方法编入了Methods in Molecular Biology系列丛书中。同年，课题组提出了一种基于磁分离的单碱基循环延伸的点突变检测方法^[12]。该方法以磁性纳来颗粒作为载体，在其上进行.单碱基循环延伸，实现对样品的准确分型。此方法的最大优点是避免了由于错配探针杂交产生的假阳性信号，因此共有极高的谁确性口同时。循环延伸所用靶序列为基因组DNA而作传统单碱基延伸法中所用的经纯化的PCR产物，因而反应步骤大大简化且非常容易实现自动化操作。

 

      自从1980年，第一台临床自动化样本处理装置被投入使用以来，越来越多的实验室自动化装置被设计、生产，投入使用。全自动装置由于具有智能、快速、准确以及不知疲倦的工作能力，它的使用能够大人提高实验室工作效率，带来强大的高通量绘测能力，将研究者从高强度的重复劳动中解放出来。随着时代的发展，其检验领域及所能涵盖的检测项目正逐渐丰富，全自动设备在临床诊断以及治疗监测等方面也发挥出越来越重要的作用。日前全球很多公司从事全自动检测设备的开发与研究，表1列出了一些国际知名自动化处理、检侧设备的生产商。

 

表1、国际上分子诊断系统主要厂商及产品

Table 1 The main corporation and products of fully automation molecule diagnostic system i

 

 

     其中比较著名的有英国的TAP(The Automation Partnership)。全球最大的实验室自动化系统供应商之一，其产品分为细胞培养与处理系统、样品管理与筛选系统两大类，提供一系列细胞培养与检侧相关的自动化系统。其中的SelecT系统能够提供高通量细胞培养和检测样木板制备，Piccdol系统能够提供自动优化蛋白质样品制备，Cello系统能够自动完成高通量克隆操作，而Homebase系统能够对生物或化学样品进行自动化存储与管理。

     Beckman Culter 是全球知名生命科学设备供应商，主要产品为Biomok系列自动工作站系统，被广泛应用十基因组研究研究领域。其系统能够完成各种样品的DNA/RNA提取与纯化、PCR反应体系建立及产物纯化、核酸适配子(Aptamer)筛选等实验。该系列产品在自动操作方而功能较强，操作精确度高，用户界面友好，操作方便，因而具有较高的市场占有率。

     世界知名分子诊断公司罗氏，开发出COBAS AMPLICORRTM Analyzer全自动PCR诊断系统，它将热循环、自动化加样、孵育、清洗与光密度测量五种仪器组合在一起，在同一仪器上实现了聚合酶链式反应扩增与检侧步骤的自动化，可用于病原体的定性或定量检测等。

     我国全白动分子诊断设备的开发仅处于刚起步阶段，市场上很少有国产成熟的拥有自主知识产权的集样本处理与分析于一体的实验室白动化设备。国内所使用的自动化设备基本为进口产品，固定的设备(生产线、仪器设查)，缺乏灵活性，使得进口仪器往往不太适应中国国情，不适用于国内一般医院，从而大大限制犷自动化装置在我国的普及。

     纵观当前全自动分子诊断设备的发展趋势，最为突出的关瀚概念是“统一化’、“集成化”以及“微型化”。

   “统一化”是指全自动分子诊断设备中应当确立一个统一的行业标准。从2000年起，美国国家临床实验室标淮委员会National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)和国际临床实验室标淮委员会（International Committee for Clinical Laboratory Standards, ICCLS)合作一直致力于制定全自动分子诊断设备统一的标谁^[13]。因此，在未来的自动化设备研制中，可以优先考虑“先软后硬”设计方法，首先要建立功能强大、且能够升级的分子诊断策略，然后根据确立的检侧策略设计与之配套的硬件，这样建立的自动化检测平台不但能大大降低仪器开发的风险，而且将来产品推向市场不会存在无配套产品的市场风险。

    “集成化”是指将各种先进分析仪器模块化后集成到一个系统中。随着对生物大分子分析、检溅自动化需求的日趋强烈，对自动化设备的功能也提出了新的要求，自动化设备需要能够将样本存贮、样本制备、分析反应二信号检测和分析等功能集成，将各种不同的功能模块优化整合在一起。“集成化’并不是将各种滚先进的仪器模块堆砌在一起，而是根据希望实现的目的，选择合适的检侧方法与检测器，合适的液体转移方式，合适的质量控制模式，优化选择、组合集成，以期能够将检测方法在仪器上完美实现。

   “微型化’是指将全自动分子诊断系统小型化以适应个体化医疗的要求，以应用于家庭、小型医疗机构以及即时诊等。“微型化”并不是将功能简化，而是利用先进的微电子、微流控芯片等技术，使全自动分子诊断设备的体积进一步缩小，以满足不同群体的需求。

    当前，国内的医疗器械研究机构应尽快开展关干全自动分予诊断仪器的研究，解决其中关键向题，研制出具有自主知识产权的全自动分子诊断系统，打破国外高端分子诊断系统在国内的垄断地位，从而填补国内在这一领域的空白。