细胞总乙酰化水平的快速测定方法
2010-01-21 22:45:17   来源：不详   评论：0 点击：

                                             细胞总乙酰化水平的快速测定方法
                                                                              -------免疫亲和色谱-ELISA 方法

步骤一：亲和色谱分离提纯乙酰化蛋白
1. 用细胞裂解液裂解细胞，10000rpm 离心2 分钟，取上清备用。
2. 取20-40ul 抗乙酰化赖氨酸抗体填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388，如右图所示)，
用PBS 洗2 次，每次1ml。
3. 将细胞裂解上清液与洗好的填料（ICP0388）混匀，39oC 旋转摇床低速孵育60 分钟。
4. 1000rpm 离心1 分钟，去上清，用PBSt 重悬沉淀，1000rpm 离心1 分钟，去上清，重复3 次，
最后一次用PBS 洗，吸弃上清。
注：细胞裂解液里应该含有蛋白酶抑制剂，组蛋白乙酰化酶抑制剂等。

步骤二：释放及包被固定分离提纯的乙酰化蛋白
5. 用20ul 0.1M HCL 将步骤2 的抗赖氨酸抗体填料-乙酰化蛋白复合物于沸水中煮2 分钟，10000rpm
离心1 分钟，将上清液体全部转移到含有80ul 的0.2M Na2CO3 的ELISA 薄板上，39oC 孵育30 分钟；
6. 取出ELISA 薄板，拍干。用PBSt 清洗2 次，每次均需拍干。加入100ul 含0.5%BSA 的PBSt ，39oC
封闭10 分钟。

步骤三：用抗乙酰赖氨酸抗体HRP 标记物检测蛋白乙酰化水平
7. 取出ELISA 薄板，拍干，用PBSt 清洗2 次，拍干。加入100ul 浓度为0.25ug/ml 抗赖氨酸抗体
HRP 偶联复合物（Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381，如右图所示），39oC 孵育30 分钟。
8. 取出ELISA 薄板，拍干，用PBSt 清洗板孔3 次，每次均需拍干。加入100ul TMB 液，39oC 孵育显色
10-20 分钟。最后加入100ul 0.1 M H2SO4 终止反应，在450nm 波长下读数。

相关热词搜索：细胞 胞总 总乙 乙酰 酰化 化水 水平

上一篇：激光扫描共聚焦显维镜定量分析的优势和注意事项
下一篇：实时荧光定量PCR的研究进展及其应用