免疫荧光组织化学的直接法和间接法
2010-01-21 22:44:59 来源：不详评论：0 点击：

免疫荧光组织化学直接法

(1)检查抗原法：此法是免疫组织化学最早使用的方法，用荧光素标记已知特异性抗体，直接与组织细胞中相应抗原结合，在荧光显微镜下可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法特异性强，快速而简便，但是，由于一种荧光抗体只能检测一种抗原，很难获得各种市售的特异性荧光标记抗体；此外，该方法敏感性较低。

(2)检查抗体法：将抗原标记荧光素，即为荧光抗原。将此荧光抗原直接与细胞或组织内相应抗体反应，即可定位检测出相应的特异性抗体。

免疫荧光级胞化学直接法示意图

直接法简便而快速，适合检测浓度较高的蛋白质抗原，如肾脏、皮肤抗原的检查。在临床上也常用于细菌、螺旋体、原虫及真菌的检测。该法基本染色步骤如下：

1．染色切片经固定后，滴加经稀释至染色效价的荧光标记特异性抗体，置人湿盒内，室温或37~C染色30分钟。

2．洗片洗去存留的荧光抗体，将切片浸入pH 7．2～7．4的PBS中振荡或摇动洗涤2次，每次5分钟，再用蒸馏水洗1分钟，除去盐结晶。

3．封固和观察用50％甘油缓冲液(pH 9．0～9．5的0．5mol／L磷酸盐缓冲液配置)封固或用抗淬灭剂封固后，置荧光显微镜下观察。

免疫荧光组织化学间接法

(1)检查抗原法：第一抗体不标记，使用与一抗种属相同抗体的Fc段(有种属特异性)作为抗原免疫动物，制备抗抗体。即第二抗体。并用荧光素标记第二抗体。反应时，首先用特异性抗体(第一抗体)与组织细胞中的相应抗原反应，然后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用荧光素标记的第二抗体与结合在抗原上的第一抗体结合，形成抗原—抗体—荧光抗体复合物。由于结合在抗原—抗体复合物上的荧光抗体数量显著多于直接法，从而提高了反应的敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个第一抗体分子，当此抗体作为抗原时，每一个抗体分子又可结合3～5个荧光标记的第二抗体分子，故与直接法相比，荧光亮度可增强3—4倍。此法只需制备有种属特异性荧光标记的第二抗体，可与多种特异性第一抗体相匹配，故目前应用最为广泛。

免疫荧光细胞化学间接法

(2)检查抗体法：常用检查抗体的间接法有两种：一种是先将特异性抗原与组织细胞内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间。故称为夹心法(sandwich method)。另一种方法是在已知抗原的细胞或组织切片上加入待检血清，如果血清中含有细胞或组织切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上形成沉淀，再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体进行反应(如检测人血清中的抗体必须用抗人IgG荧光抗体等)，利用荧光显微镜即可见抗原抗体反应部位呈现明亮特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。

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