纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定
2009-04-15 19:11:28 来源:本站原创 评论:0 点击:
1. 纤维素CMC酶
1.0标题
用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。
2.0范围
生产分析和质量控制部门适用。
3.0原理
纤维素CMC酶(EC3.2.1.4)水解羧基纤维素分子中β-1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
4.0试剂
4.1无水醋酸钠(分析纯)
4.2冰醋酸(分析纯)
4.3 3.5-二硝基水杨酸
4.4无水葡萄糖
4.5四水酒石酸钾钠(分析纯)
4.6氢氧化钠(分析纯)
4.7重蒸苯酚(分析纯)
4.8无水亚硫酸钠(分析纯)
4.9叠氮化钠(分析纯)
4.10羧甲基纤维素钠
5.0仪器
5.1水浴锅(恒温)50±
5.2电热干燥箱80±
5.3 722型分光光度机计
5.4分析天平感量0.1㎎
5.5一级玻璃制品
5.6电冰箱
6.0试剂的准备
6.1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(PH=4.8)
溶液A:量取冰醋酸6ml,定容至1000ml,制成
溶液B:称取
以A:B=4:6的比例混合,低温冷藏备用。
6.2 DNS试剂:
溶液A:称分析纯NaOH
溶液B:称分析纯酒石酸钾钠
将A、B溶液混合,定容至5000ml,贮存于棕色瓶中,暗处放置一星期后可使用。
6.3 CMC溶液:用羧甲基纤维素钠(CMC)以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。
7.0标准曲线制作:
7.1无水葡萄糖
7.2准确称取
7.3标准葡萄糖曲线制作
取1mg/ml标准葡萄糖液各0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml补加水至2.0ml,加入2.0mlDNS试剂,具塞,沸水浴中加热10分钟,冷却后定容至15ml,分光光度计550nm波长下测OD值,3次重复实验的均值用最小乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程。由光密度值引得葡萄糖量。
8.0 CMC酶活性测定。
8.1活性定义:
8.2分析程序:
取三支15ml刻度试管分别加入0.2ml稀释酶液,在分别吸取1.8mlCMC溶液,
9.0计算活力单位
A×D×5×1000
CMC酶活力=————————µ/g(ml)
30
A:OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量()
D:酶粉(液)稀释倍数
2. FPA酶
即滤纸酶,即以滤纸作为底物,因滤纸中的纤维素含量较高,FPA酶水解滤纸中的纤维素,释放出的还原糖与3.5-乙硝基水扬酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放的还原糖量成正比关系,即与酶样品的酶活性成正比关系。通过在550NM的光吸收值查对标准曲线,可以确定还原糖产生的量,从而确定酶活力单位,它也是恒量纤维素酶活的一个重要指标。
3. 半纤维素酶:
1.0标题
用3.5一二硝基水杨酸测定半纤维素酶活性单位
2.0范围
生产分析和质量控制部门适用
3.0原理
半纤维素酶水解木聚糖,释放出的还原糖(以木糖计)与3.5一二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放的还原性糖(以木糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以木糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
4.0单位定义
一个半纤维素酶单位定义为;1g酶粉(或1ml酶液)于50℃PH4.8条件下,每分钟分解1%木聚糖溶液产生一微克还原糖(以木糖)的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。
5.0试剂
5.1无水醋酸钠(分析纯)
5.2冰醋酸(分析纯)
5.3 3.5一二硝基水杨酸(分析纯)
5.4木糖(分析纯)
5.5四水酒石酸钾钠(分析纯)
5.6氢氧化钠(分析纯)
5.7重蒸苯酚(分析纯)
5.8无水亚硫酸钠(分析纯)
5.9叠氮化钠(分析纯)
5.10木聚糖(分析纯)
6.0仪器
6.1水浴锅(恒温)50±1℃
6.2电热干燥箱80±1℃
6.3 772型分光光度计
6.4分析天平感量0.1
6.5一级玻璃制品
6.6电冰箱
7.0试剂的制备:
7.1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(PH=4.8)
溶液A:量取冰醋酸6ml,定容至1000ml配成0.1MNaNC溶液。
溶液B:称取8.2gNaAC,溶解后容至1000ml,制成0.1MNaAC溶液。
使用溶液以A:B=4:6的比例混合,低温冷藏备用。
7.2 DNS试剂
溶液A:称分析纯NaoH104g,溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。B:称分析纯酒石酸钾钠910g溶于2500ml水中,再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钾钠加入酒石酸钾钠溶液,将A、B溶液混合加入1200ml中,储存于棕色瓶中,暗处放置一星期后可使用。
7.3木聚糖溶液:用木聚糖以PH4.8醋酸缓冲液配成1%溶液。
8.0标准曲线制作:
8.1木糖80℃烘干至恒重。
8.2标准称取1.000g木糖以溶于1000ml水中,加10ml叠氮化钠防腐,4℃冷藏备用。
8.3标准木糖曲线制作
取1mg/ml标准木糖液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2补加水至2.0ml,加入2.0mlDNS试剂,具塞、沸水浴中加热10分钟,冷却后定容至15ml,分光光度计550nm波长下测OD值,3次重复试验的均值用最小二乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程,由光密度值引得木糖量。
9.0半纤维素酶活性测定;
15ml刻度试管中加入稀释酶液0.2ml(三支平行样),再各吸取1.8ml1%的木聚糖溶液,摇匀,50℃水溶60分钟,取出后,再吸取2mlDNS试剂摇匀,具塞,立即沸水浴反应10分钟,冷却后,补加水定容到15ml,轻轻上下摇匀,空白用0.2ml稀释酶液加。1.8ml醋酸缓冲液,不加木聚糖溶液,同样依上述步骤,用空白调零点,于550nm下测OD值。
10.0计算活力单位:
A:OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量(mg)
D:酶粉(液)稀释倍数
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