青霉素酶发酵液的预处理和酶学特性的研究
2008-02-27 20:27:32   来源：本站原创   评论：0 点击：

青霉素酶是β-内酰胺酶的一种，在分类上属于A类，酶的活性位点上有丝氨酸，又称为活性位点丝氨酸酶，其作用机理是水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环，使抗生素失去其活性。目前，青霉素酶用于β-内酰胺类抗生素产品的无菌检验和青霉素过敏者使用，也有报道将青霉素酶制成酶电极用于肉制品与乳品抗生素残留的检测[1]。对青霉素酶研究的报道，如John imsande[2]研究了5–甲基色氨酸诱导Staphylococcus aureus青霉素酶的合成。J. F. morgan 等[3]研究了Bacillus cereus, NRRL 569青霉素酶的合成与纯化。G. A. lepage等[4]研究了Bacillus cereus and Bacillus megatherium的青霉素酶的合成与纯化。Daniel等 [5]研究了Bacillus cereus青霉素酶特殊的热力学特性。Tetsuo sawal等 [6]对Bacillus Zicheniformis 749 / C胞内青霉素酶特性与纯化进行研究，发现该酶在胞内与体外性质相似。
本文针对蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)青霉素酶制备过程中膜过滤的难题，设计了多种预处理方案，并取得了较好的效果，为大规模制备青霉素酶提供了技术支持，同时对蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)产生青霉素酶的酶学性质进行了研究。
1.材料与方法
1.1 材料
菌株：蜡状芽孢杆菌CMCC(B)63301（购于中国药品生物制品检定所）。
培养基：蛋白胨 15g，甘油 50g ， 氯化钠 4g，0.1％硫酸亚铁(FeSO4•7H2O)溶液 0.5ml，柠檬酸钠 5.88g ，20％硫酸镁(MgSO4•7H2O)溶液 1ml ，磷酸氢二钾 4g，牛肉浸膏 3g，定溶1000ml,pH7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃灭菌30分钟。
无菌检验培养基：肉汤培养基。
无菌检验方法：取青霉素酶溶液0.1mL，涂肉汤培养基上，37℃培养24h，检验是否无菌。
磷酸盐缓冲溶液（pH4.5～9.5）。
絮凝剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（本实验室自制）。
青霉素钠（华北制药股份有限公司）。
膜材料，水膜(孔径0.45 与0.22 ，直径50mm)。
1.2 方法
1.2.1 青霉素酶发酵液的制备
取蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）[CMCC(B)63301]的斜面培养物,接种培养基内,在25℃摇床培养18小时后，取此培养物接种于发酵瓶培养基内，接种量10％（体积比），同时每瓶加入无菌青霉素4500IU，在25℃摇床培养24小时，再加无菌青霉素2万IU，继续培养24小时，再加无菌青霉素2万IU,继续培养24小时,添加絮凝剂后，离心4500r/m，然后上清液在0.45 的水膜过滤，最后在无菌条件下0.22 水膜过滤。分装于适宜容器内，在10℃以下贮存，备用。
1.2.2 青霉素酶酶活性的测定
将酶稀释液(8000～12 000IU/mL)与配好的青霉素溶液（10000IU/mL）以1：2混合，在37℃恒温水浴中反应1小时，然后取出3mL反应液加入到25mL的碘水（0.01mol/L）(精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度)中，暗处放置15分钟。再用硫代硫酸钠溶液（0.01mol/L）滴定为反应完的碘, 至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。所得值记为A。此外还有空白试验，即将酶稀释液与青霉素都预热1小时，然后取2mL青霉素与1mL酶液加入到25mL的碘水中暗处放置15分钟。再用硫代硫酸钠溶液（0.01mol/L）滴定为反应完的碘。所得值记为B。根据公式求的酶活。
E＝(B－A)×M×F×D×100
式中 E为青霉素酶活力。
D为青霉素酶溶液的稀释倍数，本文中为1,只测其相对酶活。
M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L。
F为在相同条件下，每1mL的上述碘滴定液相当于青霉素的效价，为742.
其中青霉素与青霉素酶的稀释液用磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）。
酶活单位定义为上述反应条件下，每小时转化1单位青霉素钠所需的酶量，单位／(mL.小时)为一个IU。
1.2.3 过量底物下酶促反应曲线的测定
用紫外分光光度计测量溶液中青霉素钠的浓度，先制作不同青霉素钠浓度与吸光度值的标准曲线。青霉素钠溶液与青霉素酶溶液以2：1比例混合，37℃恒温反应。间隔1分钟读吸光度值一次，在标准曲线下读取青霉素钠盐的含量。
2 结果与分析
2.1 常规无菌青霉素酶酶液的制备
斜面种子----活化----种子培养----发酵培养-----发酵液----离心----上清液-----0.45 膜过滤----0.22 膜过滤----过滤液无菌检验
2.2 改进无菌青霉素酶酶液的制备
斜面种子----活化----种子培养----发酵培养-----发酵液----离心----上清液---絮凝剂预处理 ----常规抽滤-----滤液-----0.45 膜过滤----0.22 膜过滤----过滤液无菌检验
由于菌体芽孢形成，许多胞内大分子内容物释放到培养基中，使得常规的膜过滤除菌过程相当困难，1000ml酶液需要10h或更长的时间才能处理完，为了解决这一难题，我们采用添加絮凝剂的方法。本实验室研制了三种不同特性絮凝剂，其编号为絮凝剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分别进行实验，发酵液处理为1000mL，结果如图1、2、3所示。发现絮凝剂Ⅲ性能优良，1000mL的发酵液，添加20g絮凝剂Ⅲ，调pH值7.0，而且酶活损失仅5％。本实验中，未加絮凝剂发酵液，在膜过滤之前，需离心沉淀，然后上清液用硅藻土吸附，洗脱。0.45 膜过滤后，0.22 过滤较容易,本实验中只考虑0.45 膜过滤时间。

图1用絮凝剂Ⅰ预处理发酵液酶活性与过滤时间的关系
Fig1.The relation of enzyme activity and the time of filter with flocculantⅠpretreatment

图2 用絮凝剂Ⅱ预处理发酵液酶活性与过滤时间的关系
Fig2.The relation of enzyme activity and the time of filter with flocculantⅡpretreatment

图3用絮凝剂Ⅲ预处理发酵液酶活性与过滤时间的关系
Fig3.The relation of enzyme activity and the time of filter with flocculantⅢpretreatment
2.3 芽孢释放物对膜污染的影响
实验发现，膜过滤的难易程度与发酵时间呈正比，通过显微镜对菌体形态的观察表明，当芽孢释放逐渐增多，膜过滤难度随之急剧增加，表明芽孢释放伴随着大量胞内大分子的释放，培养基成分复杂，使得膜堵塞加重难以过滤。当发酵时间超过60h时，无法用膜进行直接处理。图4是100ml发酵液发酵时间对膜过滤的影响

图4 发酵时间对膜过滤的影响
Fig4. The effect of the membrane treatment on the time of fermentation
2.4 酶的特性研究
2.4.1 温度对酶活力的影响
不同的温度下测定酶稀释液的活性，结果见图5，酶作用的最适温度是55℃，即在该温度下酶的反应活性最高，当温度增加时，酶活性下降很快，70℃酶活性几乎丧失。

图5 温度对酶活力的影响
Fig.5 The effect of temperature on penicillinase activity
2.4.2 pH对酶活力的影响
在pH4.5~9.5的缓冲溶液中(以磷酸二氢钠和磷酸氢二钠作为缓冲溶液)，测定酶稀释液的活性，结果如图6。该酶的最适pH为7.0，当pH值高于7.0时，酶活性急剧下降，这可能由于pH的变化是酶的空间结构发生了改变，与底物的结合发生变化。

图6 pH对酶活力的影响
Fig. 6 The effect of pH value on penicillinase activity
2.4.3 温度对酶活稳定性的影响
分别在65℃，70℃，75℃温度下各保温15min，30min，45min后，将其稀释到一定的浓度测定其酶的活性，其酶活性的损失率（%）见图4。在65℃酶活的损失与温度成正比，当温度在75℃下保温时，酶活损失较大。

图7 温度对酶稳定性的影响
Fig. 7 The effect of temperature on the stability of penicillinase
2.4.4 金属离子对酶活性的影响
克拉维酸对青霉素酶的抑制已有报道，已有克拉维酸与阿莫西林组合的药上市。而金属离子对酶的体外作用未见详细报道，分别向酶稀释液中添加钙、铁、锌、锰、镁，金属离子浓度为0.25 ，测定其酶的活性，结果如图8。发现钙与铁对酶的活性影响不大，而二价金属锌、锰和镁对该酶有激活的作用。

图8常见金属离子对酶活性的影响
Fig. 8 The effect of metal ions on penicillinase activity
2.4.5 过量青霉素钠酶促反应曲线
青霉素钠与青霉素酶以2：1比例混合，37℃恒温反应。每间隔1分钟读数一次，在标准曲线下读取青霉素钠盐的含量，计算其浓度，其反应曲线如图6所示。根据该曲线，该酶促反映为发现其为0级反应。

图9 过量青霉素钠酶促反应曲线
Fig.9 The reaction curve of penicillinase under the full of substrate
3．结论
因来源不同，不同菌种产生的青霉素酶性质具有差异性，在生产上多用蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)生产青霉素酶。青霉素酶产品必须达到无菌要求，制备中多用膜过滤的方式完成，但由于发酵过程中芽孢释放伴随着胞内大分子的释放，致使膜过滤相当困难，本文在发酵液中通过添加絮凝剂，吸附大分子的预处理方式，减轻了后续的膜过滤的污染，使过滤效率提到10倍。
对酶学特性进行研究，表明：(1)最佳的反应温度为55℃、pH值7.0；（2）锌、锰和镁金属离子对酶活性有激活作用；（3）该酶对热的稳定性差，75℃下保温30min时，酶活损失达85％；（4）底物过量时该酶促反应为0级反应。

PREFERENCES(参考文献)
[1] Liu Ping(刘平). Detection of Penicillin Residues in Milk by ctrochemical Biosensors. dissertation for the degree for master（硕士学位论文）, Beijing normal university(北京师范大学):2005.
[2] John imsande. Repressor and antirepessor in the regulation of Staphylococcal penicillinase synthesis. Genetics,1973, 75(9): 1~17.
[3] J. F. morgan , M. E. Campbell. A rapid method for the production and isolation of penicillinase.J.Bact,1947, 6: 337~343.
[4] G. A. lepage, J. F. morgan, M. E. Campbell. Production and prrification of penicillinase.J.Bact 1946,7: 465~472.
[5] Daniel, H.williams Ⅲ, A.bondi, A.G.moat, F.ahmad. Thermostabihity of Bacillus cereus penicillinase.J.Bact. 1966,91(1):257~261.
[6] Tetsuo sawai, J.Oliver lampen. Purification and characteristics of plasma membrane penicillinase from Bacillus Zicheniformis 749/c. j.biological chemistry,1974,249(19):6288~6294.
作者简介：冯文亮（1976－）男，硕士研究生，研究方向：工业微生物发酵