枯草芽孢杆菌研究概况
2010-08-20 09:12:54   来源：高观朋新浪博客   评论：0 点击：

国内外关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有100多年的历史，早期大部分工作集中在形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。近年来，对枯草芽孢杆菌的研究渐进到遗传学与分子生物学领域，研究内容体现在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等。

2.1 国外研究概况

1945年Johnson等报道，枯草芽孢杆菌具有防治植物病害的作用。此后，用枯草芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究成为国内外研究的热点。1980年Papavizas G C报道，枯草芽孢杆菌可以防治水稻等作物的多种土传真菌病害。1992年Hwang等报道，用枯草芽孢杆菌可以防治豌豆的Rhizoctoni根腐病。20世纪90年代后，国外已有多种枯草芽孢杆菌制剂投放市场。美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)QST 713菌株和QST 2808菌株分别开发出活菌杀菌剂SerenadeTM和Souata AS，已在美国登记使用，叶面施用可防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等细菌和真菌病害。GBO3(商品名为Kodiak)和MBI 600(商品名为Subtilex)分别由美国Gustafson公司和Microbio Ltd公司开发，根部施用或拌种可防治镰刀菌(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)和丝核菌属(Rhizoctonia spp.)引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害。2001年Gustafson将解淀粉枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合制成混合生防药剂，称为BioYield。解淀粉枯草芽孢杆菌变种(B.subtilis var.amyloliquefaciens FZB24)作为植物促长剂被Taensa公司商品化生产，商品名TaegroTM。施用于温室或室内栽培树苗、灌木和装饰植物根部，可防治由镰刀菌和丝核菌引起的根腐病和枯萎病。俄罗斯全俄植保所开发了枯草芽孢杆菌可湿性粉剂Alifine-B，可用于防治多种作物真菌(Fusarium，Rhizoctonia，Ascohyta，Colletotrichum，Sclerotinia，Botrytis，etc)病害，田间防效高达60％~95％，增产达25％~35％；另一枯草芽孢杆菌产品Gamair由活菌和代谢物组成，主要防治由Clavibacter michiganense subsp.Michiganense，Erwinia caratovota subsp.Caratovola和Pseudomonas corrugata引起的番茄细菌病害。韩国Bio公司将枯草芽孢杆菌与链霉菌抗生素、植物抗真菌多糖混合制成生物杀菌剂Mildewcide，叶面喷施可防治蔬菜和葡萄霜霉病、白粉病，也可防治花卉、水果和水稻真菌病害。表1列举了美国在植物病害防治上已登记注册并商业化生产应用的枯草芽孢杆菌生防菌剂产品。

2.2 国内研究概况

国内一些单位也对具有生防作用的枯草芽孢杆菌进行了研究，涉及的防治对象有大田作物的叶部病害、土传病害和果实病害等。不同菌株的抑菌谱、抑菌作用乃至抑菌机理等亦有较大差异。现已从作物的根际土壤、根表、植株及叶片上分离筛选出多株对不同作物的真菌和细菌病害具有拮抗作用的枯草芽他杆菌菌株，并采用人工诱变方法提高了菌株的防病效率，对这些菌株进行了发酵条件的研究，分离出一些抗菌物质并对其特性进行了研究，同时开展了生防菌剂的温室和大田试验。国内已开发成功并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、依天得、根腐消等。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”(10亿／g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂)获得农业部登记注册，已在多个省推广使用，推广面积约4 667hm2，主要防治水稻纹枯病、三七根腐病、烟草黑胫病。百抗的主要有效成分是枯草芽孢杆菌B908。大田应用中，百抗对水稻纹枯病防效70％以上。其抑菌机制为营养竞争、位点占领等。南京农业大学研发的麦丰宁是由枯草芽孢杆菌菌株B3制成的活体生物杀菌剂，对小麦纹枯病田间防效达50％~80％，其防病机制主要表现在产生抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长、菌核形成和菌核萌发的抗菌物质。江苏苏科农化有限公司的纹曲宁是100亿活芽孢／ml枯草芽孢杆菌水剂和2.5％井冈霉素的复混制剂，主要防治水稻纹枯病和稻曲病。根腐消为昆明沃霖生物工程公司登记注册的由枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌复配的可湿性粉剂，通过灌根处理防治三七根腐病。武汉天惠生物工程有限公司完成登记并投产的枯草芽孢杆菌BS-208可湿性粉剂抗灰霉、白粉2种病害，为细菌性植物保护剂，是多种植物病原菌的竞争性抑制剂。它通过竞争性生长繁殖占据生存空间的方式来阻止植物病原菌的生长，能在植物表面迅速形成一层保护膜，使农作物免受病原菌为害。枯草芽孢杆菌还能分泌抑菌物质，抑制病菌孢子发芽和菌丝生长。江苏省农业科学院陈志谊等经过多年生物防治水稻病害的研究获得了防治水稻纹枯病的效果达50.0％~81.0％的枯草芽孢杆菌B-916菌株，现已在江苏等地得到广泛推广。黑龙江省科学院应用微生物研究所研发的枯草芽孢杆菌水剂主要防治瓜类及保护地蔬菜枯萎病、立枯病和豆类根腐病，已在黑龙江等地进行推广应用。。表2列举了我国在植物病害防治上已登记注册并商业化生产应用的枯草芽孢杆菌生防菌剂产品。

3 作用机制

3.1 防治植物病害

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在植物的根、茎部。目前该菌已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示出很好的病害防治效果。

枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。其主要防治对象为丝状真菌所引起的植物病害，如水稻纹枯病(Stagonospora curtisii)、小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis)、番茄叶霉病(Cladosporium fulvum)、豆类根腐病(Fusariurn graminerarum)(Rhizoctonia spp.)、苹果霉心病(Alternaria alternata)、棉花立枯病(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)等。

3.1.1 营养和空间位点的竞争

竞争作用是生防微生物发挥作用的重要机制之一。微生物竞争作用主要包括营养竞争和位点竞争。营养和空间位点的竞争是指存在于同一微小生物环境中的2种或2种以上微生物之间争夺这一环境内的空间、营养、氧气等现象。营养竞争只在少数菌株中发现。研究表明，某些菌株通过产生一种嗜铁素(Siderophores)与环境中的铁离子高度结合，使植物病原菌缺乏铁营养而不能生长繁殖，从而占据一定的生态位。位点竞争指微生物在植物根际、体表或体内及土壤中定殖，大多数枯草芽孢杆菌菌株以位点竞争占优势。Bacon分离的玉米内生枯草芽孢杆菌与玉米病原真菌串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme Sheldon)有相同的生态位。枯草芽孢杆菌能在玉米体内迅速定殖和繁殖，可有效降低串珠镰孢菌及其毒素(Myeotoxin)的积累。Asaka等研究表明，Bacillus subtilis RB14和NB22在土壤中以细胞存活一段时间后(大约14 d)主要以芽孢形式在土壤中长期存活。杜立新等通过扫描电镜观察发现，Bacillus subtilis BS-208菌株在番茄叶面分布不均，大多定殖于伤口周围、叶面凹陷处和绒毛根部，且能够在自然土壤和灭菌土中成功定殖，自然土中菌量低于在灭菌土中的菌量。何红等研究表明，辣椒内生枯草芽孢杆菌Bs-1和BS-2菌株通过浸种、灌根和涂叶处理，不仅可在辣椒体内定殖，而且可在番茄、茄子、黄瓜等多种非自然宿主植物体内定殖。

3.1.2 分泌抗菌物质

生防细菌防治植物病害发生发展的一个重要机制是产生拮抗物质。生防细菌的拮抗物质种类多，作用范围广谱。同一种拮抗物质可以由多种细菌菌株产生，而同一细菌也可以产生多种不同结构的拮抗物质。

自1945年Johnson等报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质后，半个多世纪以来人们从枯草芽孢杆菌的不同菌株中发现了60多种抗生素。枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质大多为低分子抗菌肽，有环状肽或环状脂肽，也有线状肽，分子量约1000 Da(介于300~3 000 Da)，但也有一些为蛋白类拮抗物。

3.1.2.1脂肽类抗生素

非核糖体途径合成的脂肽类抗生素(Lipopeptide Antibiotic)根据其结构上的差异分为伊枯草菌素(Iturin)家族、表面活性素(Surfactin)和Fengycin A、B，加上一些结构未知的环肽抗生素如Bacillus subtilis TG-26产生的一种新的抗真菌小肽LP-1。

3.1.2.2伊枯草菌素

伊枯草菌素是由枯草杆菌产生的一大类脂肽类化合物，家族成员包括Iturin A、B、C、D、E，芽孢菌素(Bacillomycin)D、F、L以及抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)等。它们都是由7个氨基酸残基组成的一个肽环，其中包括一个不变的DTyr2以及一个稳定的手性顺序LDDLLDL，最后连接一个C14-C17的β-氨基脂肪酸(βAA，β-amino Fatty Acides)。它们对大多数的致病酵母和霉菌具有强烈的抗菌能力。Cho Soo-Jin等报道，抑制炭疽病害的B.subtilis KS03产生的主要抗菌化合物是分子量为1 042 Da的伊枯草菌素A2。Nakayana等研究表明，某些枯草芽孢杆菌能产生抗菌物质伊枯草素(Iturin) 。除了枯草芽孢杆菌，已有人从性质与枯草芽孢杆菌比较接近的解淀粉芽孢杆菌(B.amylollquefaciens)中分离到伊枯草菌素。张桂英等选择对甘蔗黑穗病菌有拈抗作用的5个革兰氏阳性芽孢杆菌拮抗菌株和3个革兰氏阴性拮抗细菌菌株，用PCR技术扩增抗霉菌枯草杆菌素操纵元中mycB基因引。结果是5个革兰氏阳性芽孢杆菌拈抗菌株均扩增出一条大小为2.0 kb左右的特异带，革兰氏阳性芽孢杆菌基因组的PCR产物和伊枯草菌素A合成酶操纵元中的ItuB基因的同源性为97％~98％，说明抗菌作用机制和Iturin类群脂肽抗生素的产生有关。

芽孢霉素D也属于伊枯草菌素家族。它的氨基酸顺序是L-Asn-D-Tyr-D-Asn -D-Pro-L-Glu-D-Ser-L-Thr。与Iturin家族其他成员有同样的Asx-Tyr-Asx顺序。Anne-Laure Moyne等报道，枯草芽孢杆菌AU195可以产生芽孢霉素D，抑制黄曲霉毒素产生菌黄曲霉(Aspergillus flavus)。

3.1.2.3 生物表面活性素

1968年，Arima等首次发现枯草芽孢杆菌株(Bacillus subtilis)产生的脂肽类表面活性剂，呈晶状，商品名为表面活性素(Surfactin)。生物表面活性素(Surfactin)为分子量约1 000 Da的环脂肽类物质，具有抗菌、抗病毒和生物表面活性剂作用。一般认为，由枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性素无直接抗真菌能力，但是可以加强伊枯草菌素的抗真菌能力。Surfactin还能在植物的根部形成一层生物膜(Biofilm)。该膜能保护植物根部免受病原菌的入侵。枯草芽孢杆菌的S499菌株能同时产生表面活性素、伊枯草菌素和Fengyein三大类脂肽类抗生素。Surfactin是已发现的最强的一类生物表面活性剂，在医药、化妆品、微生物采油、环境治理等领域都有较好的应用前景。2003年高学文等研究发现，枯草芽孢杆菌B2菌株产生的胞外物质经盐酸沉淀、甲醇抽提，获得粗制备物。利用I-IPLC系统将粗制备物过Xterra RP18层析柱分离，获得的收集液抑制小麦赤霉病菌分生孢子萌发。通过LC-MS分析，发现B2菌株胞外存在3种抑菌物质，即脂肽类抗生素表面活性素、多烯类和一种分子量为564的结构未知的新物质。同年，他们利用MAL-DI- TOF-MS技术，鉴定了将lpaB3基因转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168菌株所构建的工程菌GEB3产生的脂肽类抗生素种类。结果表明，GEB3仅产生表面活性素(Sufactin)一种脂肽类抗生素。经LC-MS分析，GEB3产生由13、14和15个碳原子的脂肪酸链构成的标准表面活性素变异体(Stan dard Surfactin Isoforms)。生物活性检测表明，该工程菌产生的脂肽类抗生素表面活性素具有抑制小麦纹枯病菌和稻瘟病菌菌丝生长的作用。2006年别小妹等报道，Bacillus subtilis fmbR菌株的抗菌物质由C13~C15的3种Surfactin A同系物和一种羊毛硫抗生素Subtilosin组成。

3.1.2.4 Fengycin

1978年台湾植物病理学家陈升明教授在丰原市郊马铃薯田中分离出Bacillus subtil F29-3。该菌株在田间试验中可有效抑制并预防由Pyricularia oryzae、Alternaria kikuchiana所造成的植物病害。Vanittanakom等经纯化和化学分析发现，Bacillus subtilis F29-3能产生一种抑制许多丝状真菌生长的脂肽类抗生素，命名为丰原素(Fengycin)。丰原素在分子结构上含有一个由10个氨基酸所组成的环状部分及1个长链的脂肪酸支链。它是一种利用非核糖体合成机制所合成的抗生素，其合成基因由fenC、fenD、fenE、fenA、fenB所组成。丰原素合成酶共包含10个间隔区(Module)，每个间隔区均能活化一种氨基酸。这些被活化的氨基酸再依次连接，形成脂肽链。

Surfactin表现出抗病毒、抗肿瘤和抗支原体活性，作用机理是破坏病毒的脂膜。Iturin和Fengyein具有强抗真菌活性，机理是影响真菌细胞膜的表面张力，导致微孔的形成、K+及其他重要离子的渗漏，最后引起细胞死亡。脂肽类化合物可用于防治水稻稻瘟病、水稻纹枯病、小麦白粉病、小麦赤霉病、辣椒炭疽病、辣椒病毒病、番茄早疫病、番茄青枯病、黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病等植物病害以及蚜虫等虫害。

生防菌分泌的抗菌物质稳定性决定它对植物病原菌拮抗能力的持续性。有研究报道，枯草芽孢杆菌分泌的表面活性素(Surfactin)在土壤中的稳定性强于伊枯草菌素(Iturin)。土壤灌溉、土壤微生物的降解作用及抗生素与土壤中某些物质的结合都可能造成抗生素在土壤中含量的降低。

3.1.3 蛋白类抗菌物质

人们从部分拮抗细菌菌株中分离检测到蛋白类拮抗物质。这类物质包括一些酶类、抗菌蛋白和多肽类。目前已报道的枯草芽孢杆菌分泌的酶类有几丁质酶、Bacillomycin D snthetase C(309.04 kDa)、Putative sensorkinase(53.38 kDa)、Endo-1- 4-b-glucanase(46.60 kDa)、Bacillomycin D synthetase B(607.23 kDa)、Endo-1-b- xylanase(54.26 kDa)和Bacillomycin D synthetase A(448.21 kDa)等。几丁质酶是一种分解聚N-乙酰氨基葡萄糖分子的糖苷酶。Bacillus subtilis G3、地衣芽孢杆菌、短芽孢杆菌都可分泌产生几丁质酶。

国内研究者对枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的研究主要集中在抗菌蛋白的产生条件及抗菌蛋白的分离提取上。关于抗菌蛋白的分离纯化，目前普遍采用硫酸铵盐析后分步柱层析等程序逐步纯化。1993年王雅平等从丝瓜根部分离到一株强烈抑制玉蜀黍赤霉病菌的拮抗菌Bacillus subtilis TG26，并且从中分离到2种分子量为14和14.5 kDa的拮抗蛋白。这2种蛋白除对玉蜀黍赤霉病菌多个生理小种表现出强烈抑制作用外，对水稻稻梨孢、长柄链格孢、玉米小斑病菌及绿色木霉也有强烈的抑制作用。1998年谢栋等从对苹果轮纹病菌具强拮抗作用的B.subtilis BS-98菌株中纯化出抗菌蛋白X98Ⅲ，分子量为59 kD，等电点为4.5。糖、脂特异染色证明，X98Ⅲ为一种含糖和脂的蛋白，对苹果轮纹病、芦笋茎枯病都有很强的抑制作用。抑菌机理主要是溶解细胞壁，造成菌丝畸形、孢子不发芽或发芽异常。童有仁等研究了对水稻白叶枯病菌具拮抗能力的枯草芽孢杆菌B-034的抗菌物质，其作用活性的pH范围为4~12，对热稳定。粗提液经Phenyl Sepharose CL-4B柱层析、DEAE Sephacel柱层析和HPLC的Superdex75HR10/30柱层析，得到2个拮抗活性峰——P1和P2。蛋白电泳和等电点电泳显示，P2为单一蛋白带，分子量为50.3 kD，等电点为6.25。经自动Edman降解法检测和计算机检索，发现P2是一种新的功能蛋白。2005年刘永峰等用硫酸铵分级沉淀枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质，共获得8个蛋白质粗提物，其中硫酸铵饱和度为40％~50％和50％~60％提取的粗蛋白质对水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌有较强的抑菌活性，对马铃薯晚疫病菌则没有抑菌活性，经sephadex G-100层析后检测到4个蛋白质吸收峰。2007年报道从B.subtilis B-916中分离到一种新蛋白Bacisubin，分子量为41.9 kD。该蛋白具有核糖核酸酶活性和使红血球凝聚的活性，不具蛋白酶活性和蛋白酶抑制剂活性。Bacisubin对稻瘟病菌(Magnaporthe gmease)、菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)、甘蓝和花揶菜、白菜黑斑病菌(Alternaria oleracea Alternaria brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)具有抑制作用。Bacisubin使得Rhizoctonia solani菌丝顶端分枝、扭曲、肿大、破裂。从枯草芽孢杆菌B29菌株的发酵上清液中经DEAE-52离子交换层析和Bio-GelRP-100凝胶层析分离纯化到抗菌蛋白B291，分子量约为42.3 kD，等电点为5.69。抗菌蛋白B29I可推迟黄瓜枯萎病菌孢子的萌发时问，并可强烈抑制芽管伸长。分泌抗菌蛋白的枯草芽孢杆菌还有B.suhtilis B3、H110 B9601菌株。另外，枯草芽孢杆菌A430及内生枯草芽孢杆菌BS-2菌株也分泌抗菌多肽。

由此可见，不同拮抗枯草芽孢杆菌分泌产生的抗菌蛋白对多种植物病原菌具有强烈抑制作用。其抗病机制包括抑制病原菌孢子产生和萌发，使得菌丝畸形，细胞壁溶解，原生质泄露。新抗菌蛋白的获得将为抗菌基因的克隆和转抗菌蛋白基因植物的研究奠定理论和试验基础。

3.1.4 溶菌作用

溶菌作用是拮抗微生物通过吸附在病原真菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，产生溶菌物质消解菌丝体，使菌丝发生断裂、解体、细胞质消解，有的菌丝原生质凝结；或者是次生代谢产物对病原菌孢子的细胞壁产生溶解作用，致使细胞壁产生穿孔、畸形等现象。林福呈等在分离了976株细菌分离物后，发现来自甘蔗根围的一株枯草芽孢杆菌S9对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、终极腐霉(Pythium ultimum)和西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporm f.sp.niveum)在PDA平板上的对峙培养过程中不形成抑菌圈，但4 d后使上述植物病原真菌的菌丝溶解。扫描电镜观察发现，S9菌株在待测的立枯丝核菌表面形成了溶菌斑。S9菌株对立枯丝核菌的作用过程是通过吸附在病原真菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，而后产生溶菌物质消解菌丝体。许多B.subtilis类拮抗体产生的次生性代谢物质对病原菌的菌丝或孢子的细胞壁产生溶解作用，致病菌细胞壁穿孔、畸形、菌丝断裂、原生质消解、外溢而丧失活力。例如，B.subtilis PRS5菌株的代谢产物可使R.solani菌丝分隔增多、隔间变短、胞内原生质消解、胞壁大量穿孔或不规则消解、菌丝缩短、断裂、原生质外溢解体而失活。B.subtilis B-916产生的抗菌物质Bacisubin能使Rhizoctonia solani菌丝顶端肿大、破裂。

3.1.5 诱导抗性

植物的诱导抗病性即各种胁迫、刺激引发的植物对病原物致病性的抵抗作用。这些诱导因子通过激活植物的天然防御机制，使植物免受病原物危害或减轻危害。近年一些研究表明，一些病原菌进入免疫植株的穿入能力因免疫植株抑制其发育、侵入和增殖而明显降低。经诱导处理的植株有些明显降低了菌分生孢子萌发和吸器的穿入程度，有的则是菌穿人后植株迅速木质化，并伴随过氧化物酶活性的增强，因此诱导抗病性机制是复杂的。目前揭示的抗病机制表现在：①诱导木质素形成和伸展蛋白(HRGP)的积累；②诱导植保素(Phytoalexins) 沉淀；③诱导病程相关蛋白PRP的产生；④诱导酚物质的积累；⑤诱导寄主防御酶活力。

寄主防御酶系主要包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(PO)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。许多研究表明，植物抗病品种或诱导产生的抗性植株体内酶活性增强，并有PO特异同工酶的出现：PAL是莽草酸代谢途径的定速酶，是酚、植保素、木质素等抗菌物质合成过程中的关键酶。PO及同工酶在上述抗菌物质合成过程中起重要作用。在酶谱上，抗病强的谱带表现增强，PO与乙烯的合成和吲哚乙酸的作用有关，2种激素会影响代谢的巨变，并与PO一起影响酚的代谢。PPO的主要功能是将酚氧化成毒性更强的醌，PPO的升高有利于酚类物质积累和醌的大量形成。酚为木质素的前体。醌能引起植株过敏抗性反应，甚至PPO本身对植物病害也有抑制作用。植物诱导抗性的产生是通过防御酶系活动而实现的，这些酶活性与抗病性呈正相关。

近年研究发现，诱导植物抗性也是枯草芽孢杆菌生防作用的重要机制之一 一。Bacillus subtilis FZB24(r)产生与植物抗性蛋白合成基因表达相关的信号蛋白，诱导植物抗性，也通过分泌相关蛋白如丝氨酸专性肽链内切酶(Serinespecific endopeptidases)直接诱导植物抗性。Bacillus subtilis AF1处理木豆种子能诱导木豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性增加。Bacillus subtilis IN937也能诱导黄瓜对Envinia tracheiphila的抗性。水稻纹枯病生防菌B-916能诱导水稻叶鞘细胞PAL、PO、PPO和SOD活性增强，且分别在24、48、72和24 h达到最高。Tang等研究也发现，Bacillus subtilis B3能诱导小麦PO活性的增加并产生新的PO。徐韶等在对甜瓜枯萎病温室防效试验的研究中发现，内生枯草芽孢杆菌B6菌株与绿色木霉T23菌株复合处理的相对防效达82.22％，比B6和T23的单独处理分别提高32.8％和146.7％。研究表明，内生细菌B6和木霉T23复合接种，其苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶和β-1,3-葡聚糖酶比活性比单独接种有不同程度的增强。这种变化在挑战接种甜瓜枯萎病菌之后更加明显。拮抗菌处理后诱导植物体内产生一些有益于植物抗病性增强的生理生化反应，是拮抗菌制剂防病的重要机理。枯草芽孢杆菌不但能抑制植物病原菌，而且能通过诱发植物自身抗病机制增强植物的抗病性能，即诱导植物抗病性作用，是生防菌发挥生防作用的一个重要方面。

3.1.6 促进植物生长

在植物根际生活的一类具有刺激植物生长和抑制植物病原菌等综合作用的细菌群叫促进植物生长根际细菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria)，简称PGPR。除上面三种直接作用的生防机制外，1998年发现生防枯草芽孢杆菌能促进植物根系及植株生长，增强了植物的抗病性，从而间接地减少病害发生。胡小加等研究发现，枯草芽孢杆菌Tu-100对油菜、小麦、辣椒、西瓜、大豆和玉米苗期均有不同的促生效果。蔡学清等对辣椒内生枯草芽孢杆菌BS-2的研究证明，BS-2对辣椒苗有明显的促生作用，同时，该菌株还可诱导辣椒体内吲哚乙酸等促进植物生长的激素含量提高，并降低脱落酸等抑制植物生长激素的形成。

3.2 动物饲料添加剂

3.2.1 生物夺氧

早在1996年，研究动物微生态的科学家Maruta K等就发现猪采食含107cfu／g枯草芽孢杆菌的饲粮3周后，粪中双歧杆菌数量显著上升，而链球菌和梭菌的数量显著下降，并且这种趋势在仔猪较母猪更明显。他们的研究表明：幼龄畜禽出生时，其消化道内通常是无菌的，出生后3h在胃肠道中可发现入侵的细菌，12h后，可在大肠中检测到。按着需氧菌、兼性厌氧菌、严格厌氧菌的演替顺序，最终形成以乳酸杆菌、双歧杆菌等厌氧菌为优势菌群。芽孢杆菌为需氧菌，在生长过程中需要大量的氧气，进入动物肠道内，消耗大量的游离氧，降低了肠内氧浓度和氧化还原电势，改善了乳酸杆菌、双歧杆菌等厌氧菌的生长环境，有利于厌氧菌的生长，保持肠道微生态系统的稳衡，同时使肠道中原本存在的需氧菌肠杆菌等的生长因缺氧受到抑制，提高动物机体抗病能力，减少胃肠道疾病发生几率。

3.2.2 拮抗致病微生物，改善体内外生态环境

很多学者的研究证明动物饲喂芽孢杆菌后，能显著降低肠道大肠杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌的数量，使机体内的有益菌增加而潜在的致病菌减少，因而排泄物、分泌物中的有益菌数量增多，致病性微生物减少，从而净化了体内外环境，减少疾病的发生。氨、胺、吲哚、硫化氢等物质在肠道粘膜对细胞有明显的毒害作用，芽孢杆菌抑制了有害微生物，进而减少有害物质产生，有利于动物健康和生长。陈兵(2002)研究SD大白鼠口服芽孢杆菌(枯草杆菌)1周后粪便中厌氧菌群和需氧菌群的变化，结果表明肠道厌氧菌群中的双歧杆菌、乳酸杆菌、梭菌和拟杆菌数量均有不同程度增多，其中双歧杆菌从8.510±0.449增加至9.278±0.244(1g cfu／g)；而肠杆菌、肠球菌等需氧菌群数量则明显减少，肠杆菌从8.213±0.426减少到7.709±0.372 (1g cfu／g)。

3.2.3 增强动物体的免疫功能

近年的研究表明，芽孢杆菌能促进动物肠道相关淋巴组织处于高度的“免疫准备状态”，同时使免疫器官发育加快，免疫系统成熟快而早，T、B淋巴细胞数量增多，动物体液和细胞免疫水平提高。Inooka等(1986、1988)研究表明以107 cfu／g剂量的枯草芽孢杆菌饲喂雏鸡时，将显著提高脾脏中T、B淋巴细胞量，但对脾脏中巨噬细胞活性没有影响。目前有学者认为：芽孢杆菌作为非特异性免疫因子，通过细菌本身或细胞壁成分刺激机体免疫细胞，使其激活，产生促分裂因子，促进细胞活力或作为佐剂发挥作用；此外，还可发挥特异性免疫功能，促进B细胞产生抗体的能力。大多数学者认同的观点是动物口服饲用芽孢杆菌后，调整肠道菌群，使肠道微生态系统处于最佳的平衡状态，同时各正常菌群包括口服的芽孢杆菌在肠道具有抗原识别部位的淋巴组织集合上发挥免疫佐剂作用，活化肠粘膜内的相关淋巴组织，使SIgA抗体分泌增强，提高免疫识别力，并诱导T、B淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子，通过淋巴细胞再循环而活化全身免疫系统，从而增强机体的非特异性和特异性免疫功能。

3.2.4 产生多种消化酶

芽孢杆菌能提高动物生产性能是其产生多种消化酶的一个重要体现，这一点上枯草芽孢杆菌显得尤为突出。枯草芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶，如果胶、葡聚糖、纤维素等酶，其中很多是动物本身不具有的酶。Popova等(1995)研究发现分离得到两株枯草芽孢杆菌具有能分泌大量的细胞外酶如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶及卵磷脂酶。Kerovuo等(1998，2000)成功地从枯草芽孢杆菌中分离出植酸酶基因，并将其在胚芽乳杆菌中进行表达。

3.2.5 产生多种营养物质

芽孢杆菌在动物肠道内生长繁殖，能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、有机酸、促生长因子等，参与动物机体新陈代谢，为机体提供营养物质。Ozols等(1996)对从肠道中分离的106株菌研究后认为芽孢杆菌是动物体内维生素B1和B6的主要生产者。倪学勤等(1998)对30株饲用芽孢杆菌进行研究发现，分泌赖氨酸超过70mg／l的菌株达21株。

4 应用

随着人们对枯草芽孢杆菌研究的深入开展，发现其在工业、农业、医药卫生、食品保健、水产养殖、环境保护等方面具有广泛应用价值。

4.1 枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用

工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。据来自BBC的统计数字，2004年全球酶的交易额达到20.0亿美元(15.3亿欧元)，其中食品酶占29％，饲料酶占15％，一般的工业酶占56％。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生产应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50％。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。

枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其自身含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力。研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶。在过去的10年，利用基因工程技术，枯草芽孢杆菌几乎可以在短期内大量生产任何种源的新酶，从而省略了大量的原始菌种改造、驯化、毒理学实验等工作；利用蛋白质工程技术，能够在生产新酶之前对该酶的性质进行改良和调整，从而改善酶的活性或者赋予酶新的所需性质。这些新技术的应用使新酶种的开发周期大大缩短，难度和成本降低，产品更加稳定有效。

枯草芽孢杆菌生产的蛋白酶、淀粉酶是工业酶中应用最为广泛的酶，仅二者就占到了整个工业酶市场的50％。其中，淀粉酶的生产和应用处于整个酶制剂的首位，其最早是在20世纪初，由德国的Boiden和Effront先后从枯草芽孢杆菌培养液中分离出的；蛋白酶主要用于制革、丝绸工业及制造加酶洗涤剂等方面。目前，枯草芽孢杆菌酶市场营业额的90％以上掌握在加多家工业酶企业手中，仅Nonozymes和Danisco两家公司就占到了60％以上。我国酶制剂工业近年来取得了长足的发展，但仍无法跟上世界同行业发展的步伐，科研乏力已成为制约中国酶工业发展的瓶颈因素。

枯草芽孢杆菌酶的主要应用领域是食品工业，全世界食品工业用酶约占总量的60％，而我国则高达85％以上。这些酶在动物蛋白水解行业中的骨素加工、植物蛋白水解中的大豆蛋白和大豆肽生产、乳制品和婴儿食品生产等工业过程中都已得到广泛的应用，如在面包生产中α-淀粉酶、蛋白酶能有效提高面团工艺性能和面包质量(体积、内部结构、风味等)，并延长面包保鲜期；在啤酒生产中，采用淀粉酶的新型辅料液化工艺以及复合酶制剂的应用对提高我国啤酒的产量和质量有重要意义；在玉米深加工领域，采用耐高温淀粉酶和糖化酶的“淀粉喷射液化”技术以及“双酶法”糖化技术全面带动了我国淀粉糖、味精和柠檬酸等生产工艺的改革；蛋白酶还可用于鱼虾等海产品下脚料的加工，用于生产调味剂添加于食品中，不但提高了食品营养价值，增进经济效益，而且还变废为宝，降低了环境污染。近年来，蛋白酶、果胶酶和纤维素酶等在果酒、果汁、调味品、烘焙、肉制品和中药有效成分提取以及多肽保健品生产中的应用也都取得了较大的进展。

4.2 枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用

枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用。美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM。并于2000年通过美国环保局(EPA)的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。枯草芽孢杆菌MBI600在英国的MicroBio Group Ltd.、日本的Idemistu Kosan Co.，Ltd.等均已获得注册登记，并进行产业化生产，用于防治叶部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)。枯草芽孢杆菌FZB24在德国、美国等国家进行了注册，并在德国Bayer公司投入生产，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂。澳大利亚开发的B.subtilis A-B对麦类和胡萝卜立枯病等具有很好的防治和增产作用。此外，L．R．Cavaglieri等从玉米根围分离获得的生防菌株B.subtilis RC8、RC9和RC11对玉米轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)具有强烈的抑制作用。

我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。其中，江苏省农业科学院植保所选育的枯草芽孢杆菌B-916对水稻白叶枯病菌有良好防效。南京农业大学开发的生防菌B3(麦丰宁)对小麦纹枯病田间防效达50％~80％。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”已在农业部登记注册，并在多个省推广使用，其有效成分是枯草芽孢杆菌B-908，大田应用中对水稻纹枯病防效达70％以上。另外，由陈延熙等研制的增产菌已在全国10多个省、市的50余种作物中推广使用，主要用于防治水稻稻瘟病、小麦纹枯病和油菜菌核病等，田间增产率达10％~50％，“增产菌”成为我国第一个生物制剂方面的专利，达到国际领先水平。

4.3 枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用

枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。如，研究发现猪采食含107CFU／g枯草芽孢杆菌制剂的饲粮3周后，粪中双歧杆菌数量显著上升，而链球菌和梭菌的数量则显著下降，且这种趋势仔猪较母猪更明显；猪饲料中添加枯草芽孢杆菌不仅可以提高饲料转化率和氮利用率，而且可以减少氨的产生。此外，枯草芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱和耐挤压等特性，在饲料加工中保存良好，有利于推广应用。1996年，枯草芽孢杆菌作为我国农业部正式批准的6种生物兽药之一已投入工厂化生产。

4.4 枯草芽孢杆菌在医药卫生领域的应用

研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。最近，科学家发现从枯草芽孢杆菌提取到的淀粉酶、纤维素酶能够补充体内消化酶的不足，恢复正常消化机能；蛋白酶能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。日本人日常生活中食用的纳豆就是利用枯草芽孢杆菌生产的，研究表明，纳豆中含有的溶栓酶(纳豆激酶)对心血管疾病有很好的预防和治疗作用；而同样由枯草芽孢杆菌合成的聚谷氨酸可用作药物缓释材料和医用高分子纤维材料等。

4.5 枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用

枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体以及有害气体(氨、硫化氢等)，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等)，后分解为更小分子的有机物(氨基酸、低级脂肪酸、单糖、环烃等)，最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD，使水体中的氨基氮(NH3-N)、亚硝基氮(NO2-N)和硫化物浓度降低，从而有效地改善水质，同时还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。这些浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解提供氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环；另外，它们分泌的多种酶类和抗生素可以抑制其他细菌的生长，进而减少甚至消灭水产养殖动物的病原体。越来越多的学者已通过研究发现，枯草芽孢杆菌可在水产养殖中发挥重要的作用。

4.6 枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用

尹文林等不同养殖水体用20亿／g枯草芽孢杆菌B115株0.5 mg／L后，对养殖水体的溶氧和pH无明显的影响；氨氮最大降解值出现在使用后的第3~4天，平均降低(45.40±5.06)％；亚硝酸盐氮的最大降解值出现在使用后第3天，平均降低率为(16.03±3.82)％；硫化物的最大降解值出现在使用后第3.4天，平均降低率为(23.01±7.27)％。与对照组相比有明显差异(P >0.1)，对总大肠茵群也有明显的抑制作用。胡咏梅等以5种模拟的污染水样对枯草芽孢杆菌FY99-01菌株的净水作用进行了研究。结果表明，该菌株能迅速降解有机物，在不同处理条件下水样的COD值都有明显的下降，48 h COD的去除率达67%以上，96 h厌氧条件下反硝化强度为50.2%，好氧条件下为28.6%，144h总残渣、过滤性残渣的降解率分别为61.3%和24.1%，96h降解硫化物达100%。此外，枯草芽孢杆菌在降解多环芳烃和乐果方面也有较好的应用前景。李丽等从长期受多环芳烃污染的土壤中分离出1株菲降解菌—菌Ⅱ，经生理生化及16SrDNA析鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌。在单基质菲、芘反应体系中，该菌株具有较强的降解能力。菌不但可以在高浓度的多环芳烃存在下生长良好而且对高浓度多环芳烃有较高的降解能力。马丽娜等筛选出的一株枯草芽孢杆菌在乐果浓度为1000mg／L时，48h的降解率l8.1％。

5 展望
植物病害生防枯草芽孢杆菌的研究开发应用目前已取得了令人瞩目的成就，但其发展过程中仍存在不少问题，其中突出的有以下几个方面。

5.1 产品标准化

农药产品的质量标准中，只考虑药效问题，而对一些有害杂质含量没有明确限制，导致某些企业片面追求药效而忽视了可能产生的副作用，2004年国家工商总局组织辽宁地区市场抽查，共抽查38个经销单位的60个产品。杀菌剂的合格率仅为3.7％。枯草芽孢杆菌产品的有效成分标准化混乱，有些以活芽孢数作为标准，有些以有效杀菌成分为标准，另外有效杀菌成分的检测也没有统一标准。通用名称也没有统一标准。

5.2 生产成本过高

枯草芽孢杆菌发酵过程中有效杀菌物质分泌量普遍过低，且生产过程中污染严重，这些都使生产成本居高不下。产品研究开发周期过长，防治效果慢、防治对象较单一等间接导致生产成本过高。

5.3 土传真菌病害的防治

枯草芽孢杆菌防治土传真菌病害缺少基础理论研究，土壤微环境的复杂性使得这方面的研究报道很少。田间应用时因受到土壤温度、湿度、pH值、作物生长状况及土壤中原本存在的微生物种类等因素的影响，使得枯草芽孢杆菌生长不稳定，分泌的有效杀菌物质被降解，因此防治效果不稳定。

尽管当前化学杀菌剂在农药产业仍占主导地位。但枯草芽孢杆菌杀菌剂具有对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，因而更符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治(IPM)的要求。枯草芽孢杆菌抗菌物质的分离纯化及抗菌作用的分子机制、拮抗基因的克隆及其表达调控等研究已经积累了丰富的资料，具有重要的理论意义和指导生产价值。现代生物技术的广泛应用、基因组学和蛋白组学的发展以及先进的仪器设备的应用必将为枯草芽孢杆菌植物病害生防研究开发带来新的发展机遇。