微生物发酵法生产肌醇的研究
2006-09-17 17:24:53   来源：不详   评论：0 点击：

(自然界中肌醇一般以肌醇六磷酸酯即植酸的形式存在,本站站长注.)
1　肌醇简介
    1850年Beckett.C.〔1〕等人从动物组织的抽提液中发现了肌醇(myo-inositol),1928年Eastcott.E.〔2〕从生物活素I中制成了纯净状态的肌醇.但直至1940年Wooley.D.〔3〕才首次发现由抽提液提取所得的肌醇对小白鼠具有抗脱毛作用,这类肌醇后来被称为具有类似维生素活性的肌醇〔4〕——肌醇(inositol)的9个立体异构体中的一个,即内消旋(1,2,3,5—顺式)环己醇.在Wooley.D.研究报道之后,有关这种肌醇的研究逐步深入,尤其是进入本世纪八十年代以来,研究含有肌醇(myo-inositol)结构的各种磷脂肌醇的报道大量出现.肌醇(myo-inositol)仅存在于动植物、微生物体内,具有许多生理功能〔5〕,它是细胞膜的组成成分之一,在膜磷脂平衡中扮演着重要的角色〔6〕,它还参与蛋白质的生物合成、CO2固定和促进脂肪代谢等过程.磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸至少是胞内3个第二信使的前体.1,3,4,5-四磷酸盐肌醇具有第二信使生理功能〔5,7〕.1,4,5-三磷酸肌醇为细胞内信使,在钙平衡和信息传递方面起着重要的作用〔8,9〕.
    肌醇对人的多类型细胞的生长是必须的〔4〕.美国1987年公布含奶的婴儿食品中应加入肌醇〔10〕.动物生长期,特别是快速生长期间,肌醇能刺激肌体加速生长〔11〕,在此方面肌醇已作为养殖业饲料必需添加的成分.人体肌醇缺乏时,膳食中脂肪酸能使肝脏中甘油三酸脂积累导致疾病发生,肌醇缺乏是致病的条件〔4,11〕.肌醇在医药上已作为脂肪肝脏等疾病的辅助治疗药物.近年来,随着对肌醇作用和潜力认识的深化,国际市场对肌醇的需求逐年增加.中国生产的肌醇90%以上用于出口,1993年出口1135吨,创汇1020万美元,1994年出口1193吨,创汇1938万美元,1995年出口1257吨,创汇2716万美元〔12〕,呈量增价长趋势.
    植酸盐具有强烈的抗营养作用〔13,14〕.植酸盐被证明与基本的残余蛋白质相互作用抑制大量的消化酶〔15〕,哺乳动物消化系统无植酸酶,大多数动物也缺乏该酶〔11〕,故植酸盐不能直接作为营养物质,而肌醇能被动物内脏吸收及作为肠道菌产生维生素的物质.目前普遍使用化学提取法以脱脂米糠为主要原料生产肌醇,其植酸盐的提取率一般在90%以上,植酸盐水解后肌醇得率一般在10%〔16,17〕,肌醇产率约为1%,此法的主要优点在于它有效地利用了农产品加工的下脚料等再生资源.但由于肌醇的提取要经过浸提制备植酸盐、植酸盐水解为肌醇及其溶液的制备等过程,而这些过程中需要耐酸设备,工序复杂,因而生产费用高;其次,往往因原料带有不易除去的杂质而导致产品质量下降,若重新二次结晶则再次增大操作费用且产品出率降低增大成本〔16〕.由于上述生产方法存在缺陷,近年来日本已有用多种耐酸微生物混合菌群、植酸酶等对原料中的植酸盐进行分解制备肌醇的报道〔18,19〕,但这种方式的生产亦属于化学提取法生产类型并与世界肌醇总产量的增加无关,所以肌醇供求之间的矛盾必须通过其它途径来解决,而用微生物发酵法生产肌醇正是解决这一矛盾的途径.近几十年来细胞生物学的研究不断深入,使得酵母类菌的肌醇代谢途径已基本明晰〔20〕,利用微生物发酵法进行肌醇生产的研究时机已经成熟,国际上已有一些报道〔21,22〕.发展和应用生物高新技术,用其推动肌醇生产,提高产品纯度,逐步降低产品成本,是肌醇生产研究的趋势.目前微生物发酵法肌醇生产研究已成为生物工程应用研究的一个课题.
2　微生物发酵法生产肌醇的研究进展
2.1　研究背景微生物中肌醇的研究始于1945年Beadle和Tatum〔23〕报道的从真菌突变株中分离得到肌醇营养缺陷型菌株,此后有多人对真菌肌醇的生物合成途径进行了研究.1976年Cul-bertson和Henry〔24〕报道了分泌肌醇的酵母菌S.cerevisiaes(ino+)的肌醇生物合成的控制,其生物合成的关键酶在50μm肌醇存在下活性受到急剧抑制.1981年Breenberg〔25〕等人采用遗传工程方法研究,揭示S.cerevisiaes中至少存在OPI1、OPI2、OPI43个基因位点,它们对肌醇的生物合成关键酶的合成起着阻遏作用,它们之间及与产生肌醇合成关键酶的基因INO1互不连锁.1990年White和Henry〔20〕采用基因工程技术发现并证明了OPI1是磷脂生物合成的一个负调控基因,它编码的蛋白质是肌醇生物合成的一个负调节子,在此研究的基础上通过切除OPI1基因位点获得了能多产肌醇的基因工程菌YS2(ATCC-74033)〔26〕等.
     S.cerevisiaes磷脂生物合成途径〔20〕之一:

    
2.2　微生物发酵法肌醇生产研究进展
     微生物发酵法肌醇生产是建立在近几十年来对酵母菌肌醇代谢途径的理论研究已取得一定成果的基础之上的.微生物发酵法肌醇生产研究仅是近几年才开展的一项研究.
     发酵法肌醇生产主要以混合糖类为原料,以酵母或假丝酵母为主要生产菌经发酵分泌肌醇到发酵液中,发酵终了经对发酵液进行处理,最后浓缩结晶制得高纯度的肌醇产品.
     从生产研究角度看,目前日本的Shirai.M.〔21〕等人及美国的Agrawal.P.〔22〕等人的研究已取得了一定成果.
     Shirai.M.等人利用葡萄糖代谢拮抗物从诱变的假丝酵母中选育出产肌醇较多的DGR1-14(FERMP-1439或FERMBP-5070)等菌种,用其进行肌醇发酵研究.碳源采用各种糖、淀粉及纤维素的水解物、乙醇、有机酸等,其浓度为1%～15%.氮源采用乙酸铵、氨气、氨水、NH4Cl、(NH4)3PO4、(NH4)2SO4之一或结合使用,其用量为0.1%～0.4%.微量有机物质采用添加0.000001%～0.5%生长素或维生素,或采用添加0.01%～5%的玉米浆、蛋白胨、酵母抽提液等.此外,控制pH3～8,温度20～30℃,通气条件下搅拌34～96h,结果产肌醇量在0.4～3g/L之间,此后经过滤、浓缩、结晶制得肌醇产品.
    Agrawal.P.〔26〕等人利用S.cerevisiaes基因工程菌YS2(ATCC-74033)、YS3(ATCC-74034)进行了发酵法肌醇生产研究.分别采用合成营养和一种称作杏仁壳浸渍汁的物料进行发酵试验,结果表明合成营养物比单糖发酵液中肌醇浓度大,连续发酵比间歇发酵所产肌醇含量高,杏仁壳浸渍汁比其它两类培养基发酵效果好.采用杏仁壳浸渍汁培养基连续发酵发酵结束后肌醇含量达9g/L,发酵时间分别在40～120h之间,产物乙醇分别在2～6.2g/L之间,细胞含量分别在0.15～5.8g/L之间,氮源以(NH4)2SO4为主.从可获得的资料分析知,因培养基不同,其发酵类型表现为一、二型发酵,其发酵过程中有厌氧发酵阶段,较高浓度的葡萄糖对肌醇产生有抑制作用.
    近期Prawal.P.〔27〕等人采用不先利用肌醇的野生酵母S.cerevisiaes(DD2、aDD2)对含糖、肌醇、山梨醇等不同成分的培养基进行发酵研究,发酵终了除山梨醇因培养基成分和aDD2、DD2两种菌性能不同含有不同量外,其它糖类均在38h前被完全转化为乙醇和细胞.经DD2、aDD2发酵处理过的肌醇发酵液在浓缩结晶后得到了高纯度的肌醇结晶产品.
    综上所述,微生物发酵法生产肌醇正日趋成熟.虽然应用假丝酵母菌发酵其发酵液中肌醇含量偏低,但应用基因工程菌YS2、YS3发酵,发酵液中肌醇浓度接近或超过了化学提取法水平,并且应用aDD2、DD2等野生菌能对肌醇发酵终了醪液中的残糖等杂质进行清除,此为又一优于化学提取法的一个特点.再则其它多元醇因与肌醇结晶条件不同可在肌醇结晶时除去,因此应用发酵法生产肌醇最终可获得高纯度的肌醇结晶物.总之发酵法生产肌醇已有一条基本完整可行的途径,虽目前尚未有投产的消息披露,然而如前所述应用生物高新技术的成果——基因工程菌等,显然是肌醇生产的发展方向,其产品将具有很高的国际竞争力.
3　微生物发酵肌醇生产可能存在的问题及研究方向
     微生物发酵法肌醇生产具有巨大的优势和潜力,在对一些问题作进一步的全面研究之后,可望投入工业化生产.今后的研究方向包括:
    (1)进一步改造菌种,选育葡萄糖结构类似物等抗性高产菌株,深入研究肌醇发酵机理,实行有效代谢调控方案.
    (2)优化培养基成分,提高I1PS的活性,改善细胞壁、膜的通透性,优化工艺条件,最终提高发酵液中肌醇的浓度.
    (3)寻找廉价易得的培养物,研究细胞回流反应等问题,进一步降低成本,提高转化率.