香菇菌富硒液体发酵条件的优选试验
2009-05-25 14:24:44   来源：本站原创   评论：0 点击：

[摘要] 在香菇菌液体发酵的基础上，先对香菇菌种加硒驯化，再进行富硒香菇液体深层发酵的工艺条件实验。研究香菇菌丝体在发酵过程中对有机硒的耐受力和生物转化力。结果表明：经过驯化后的香菇菌在含有60 mg/kg 亚硒酸钠(Na2SeO3)的固体培养基上和含有80 mg/kg亚硒酸钠 (Na2SeO3) 的液体种子培养基及含有130 mg/kg亚硒酸钠 (Na2SeO3) 的液体发酵培养基中生长良好，并可以在菌丝体内富集硒。

　　[关键词] 富硒香菇；菌种加硒驯化；液体发酵
　　
　　
　　
　　香菇（lentinus edodes）属担子菌纲伞菌目香菇属。从香菇中提取的香菇多糖颇受医药学科研究工作者的重视，特别是富硒香菇多糖。据现代研究证实它具有较强的抗病毒、抗肿瘤、抗衰老等作用。是辅助性T细胞活性的恢复剂和巨噬细胞参与的T细胞免疫增强剂。但是，由于产量低价格昂贵，临床应用受到一定限制[1-3]。
　　如果在香菇菌液体发酵时，把亚硒酸钠添加到培养基中，通过菌丝细胞内物质代谢转化，使有机硒结合到大分子活性物质上，成为有机硒多糖和硒蛋白。用这种方法得到的富硒香菇产品，较栽培法具有周期短，效率高，成本低等优点，是食药两用的优良产品。
　　本实验在原香菇菌深层发酵的基础上，对富硒香菇的液体发酵条件，进行了初步的探讨。
　　1实验材料
　　1.1出发菌株
　　由本室提供
　　1.2培养基
　　1.2.1基础斜面培养基（PDA）土豆（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）3 g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）1.5 g、水1 L、pH6.0。
　　1.2.2基础种子培养基蔗糖20 g、葡萄糖20 g、黄豆饼粉10 g（浸出液）、 酵母粉4 g(酶解)、蛋白冻2 g、玉米粉10 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1 g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.6 g、水1 L、pH6.0。
　　1.2.3基础发酵培养基蔗糖20 g、葡萄糖20 g、黄豆饼粉15 g（不必制成浸出液）、 酵母粉4 g(酶解)、蛋白冻2 g、玉米粉10 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1 g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.6 g、 水1 L、pH6.0。
　　1.3化学试剂
　　亚硒酸钠(Na2SeO3)及其他化学试剂均为国产分析纯。
　　2实验方法
　　2.1 香菇菌种加硒驯化
　　将4℃冰箱保存的香菇菌，接种到基础斜面培养基上，进行活化培养，传至3代后，菌丝生长丰满，为实验用斜面。采用梯度法，在固体培养基中逐步增加硒的含量，浓度分别为20、40、60、80、100 mg/kg Na2SeO3诱导菌丝体对硒的耐受能力。方法为：将活化好的母斜面在无菌条件下，取适量菌丝，接种到含硒20 mg/kg的斜面培养基上，26℃恒温培养。72 h后，每隔24 h观察一次菌丝生长情况。当菌丝长满斜面时，再接入到含硒40 mg/kg斜面培养基上培养。以此类推逐级驯化，每个梯度接种5支斜面并根据菌丝生长情况进行重复培养。
　　2.2摇瓶种子培养
　　在500 ml三角瓶内，装入80 ml分别含有 60、 70、 80、 90、100 mg/kg Na2SeO3种子培养基，以无硒种子培养基作对照，取经过初步驯化的香菇菌斜面，挖块约1 cm2接入瓶内，置26℃恒温摇床，170 r/min，培养7 h，测定菌丝干重。
　　2.3摇瓶发酵培养
　　在500 ml三角瓶内，装入100 ml分别含有70、90、110、130、150、170 mg/kg Na2SeO3发酵培养基, 以无硒发酵培养基作对照，将加硒培养的种子液接入发酵瓶内。初始pH值6.0，26℃恒温摇床170 r/min，培养7 h，测定菌丝干重。每个梯度重复3个样本，重复3批，取平均值。
　　2. 4分析测定
　　2.4.1菌丝干重测定 取发酵液100 ml, 经5 000 r/min离心15 min，收集沉淀菌丝体60℃烘干至恒重，电子天平称重。
　　2.4.2菌丝体内硒含量测定 由中国疾病预防控制中心营养与食品安全研究所测定。
　　2.4.3 pH值测定 pH酸度计。
3结果与分析
　　3.1香菇菌固体培养加硒驯化
　　在基础固体培养基中，分别加入20、40、60、80、100 mg/kg Na2SeO3取适量菌丝首先接种到含硒20 mg/kg的固体培养基上，培养72 h开始查看，可见到绒毛状白色菌丝长出，培养到第6天时，菌丝已长满斜面，色白、丰满厚实，显微镜观察：菌丝长且粗壮。与基础固体培养基上生长的菌丝比较，差别不大，可以转接到下一浓度培养基中。当接种到含硒60 mg/kg的固体培养基时，菌丝生长略迟缓，需要培养8 d才能长满斜面，与基础固体培养基上生长的菌丝比较，不够丰满厚实，经重复传代后能够生长良好。随着硒浓度的递增，斜面培养时间需要不断增加。接种到含硒 100 mg/kg的固体培养基时，培养时间延长到15 d菌丝也难长满斜面，显微镜观察：较基础固体培养基上生长的菌丝明显短、细，重复传代越长越弱。
最后以含硒60 mg/kg固体培养基上生长丰满的菌丝斜面为发酵用菌种。
　　3.2 不同加硒量对液体种子生长的影响
　　香菇菌种经过固体培养基加硒驯化后，对硒有了一定的耐受力，再在液体种子培养基中进一步诱导。结果表明: 随着硒添加量的不断增加，对菌丝体生长的抑制力不断加大，培养基中Na2SeO3 量在60～80 mg/kg时菌丝量下降较平缓，当添加到90 mg/kg以上时菌丝量明显减少（表1）。为了保证液体种子的质量，以80 mg/kg为Na2SeO3选择添加量。
　　
　　表1不同加硒量对液体种子生长的影响（g/100 ml）
　　
　　 3.3不同加硒量对发酵的影响
　　通过前两级对香菇菌加硒驯化培养，为富硒香菇深层发酵打下了一定基础。下一步，继续探索香菇菌在发酵过程中对硒的耐受力和菌体内硒的转化量。结果显示：随着硒量的不断加大，菌体内硒的转化量不断增加。而加大到150 mg/kg以上时，硒的转化量并没有明显增加，但对菌丝体生长的抑制力却十分明显，因此确定发酵培养基中硒添加量以130 mg/kg为最佳（表2）。
　　
　　表2 不同硒量对发酵的影响
　　
　　3.4接种量对菌体生长的影响
　　将培养7 d的香菇菌种子液分别以2% 、4%、6%、8%、10%、12% 6个不同浓度，接入发酵瓶内，置26℃恒温摇床170 r/min培养。结果（表3）随着接种量的加大，菌体生长度不断增加。但考虑到时间、成本等多方面因素，以8%～10%为最适宜接种量。
　　
　　表3接种量对菌体生长的影响
　　
　　3.5培养时间对菌体生长及pH值的影响( )
　　将培养5 d的香菇菌种子液按10%接种量接入发酵瓶内，置26℃恒温摇床170 r/min培养。从72 h开始至216 h止，共分7个时间点，每隔24 h取样3瓶，镜检菌丝形态、测定菌丝干重及pH值变化。结果（表4）富硒香菇菌随着发酵时间的延长pH值不断下降，菌丝量不断增加。培养到144 h后pH值变化平缓，菌丝量增加明显。镜检菌丝形态，胞浆染色深，偶见空胞。培养到216 h后pH值有所回升，菌丝量开始下降，镜检菌丝形态，可见大量空胞，胞浆染色淡，已经老化。因此富硒香菇菌液体发酵的时间以168～192 h，pH值4.0左右为最佳培养时间。
　　
　　表4培养时间对富硒香菇菌体生长及pH值的影响
　　
　　综上所述，经过实验可以确定，驯化后的香菇菌在含有60 mg/kg Na2SeO3的固体培养基上和含有80 mg/kg Na2SeO3的液体种子培养基及含有130 mg/kg Na2SeO3 的液体发酵培养基中生长良好，且通过液体培养可以使有机硒转化到菌丝体内。培养温度26℃、初始pH值6.0、接种量8%～10%、摇床转速170 r/min、8 d培养为最适宜发酵条件。采用液体发酵的方式获得富硒香菇产品是切实可行的。

　　[参考文献]
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