高纳豆激酶酶活枯草芽孢杆菌的筛选及菌种鉴定
2010-07-24 21:39:11   来源：国家食物与营养咨询委员会   评论：0 点击：

马  明1，杜金华1，2*，于  玲1，王  囡1
（1山东农业大学生命科学学院，泰安  271018；2山东农业大学食品科学与工程学院，泰安  271018）

摘  要：为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品，对能产生纳豆激酶的菌株进行了分离筛选，得到了具有较高纤溶活性的四株，考虑到发酵后的纳豆感官，我们最终选择编号为4411、465的菌株作为生产用菌种。根据其形态、生理生化特征以及与枯草芽孢杆菌的比较，初步判断这两株菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
关键词：纳豆激酶；枯草芽孢杆菌；筛选；鉴定

心脑血管栓塞性疾病是目前全世界范围内危害人类健康生命的主要原因之一，据世界卫生组织2000年的统计，世界死亡病例的29%与其有关［1］。在北美，心脑血管疾病已经成为主要的致死病因。我国现有脑血管病人700万，年新发病人250万，年死亡120万，全国在这个疾病上全年花费超过300亿元。目前常用及有待开发的治疗血栓病的药品有［2］：链激酶（SK）、尿激酶（UK）、重组组织纤溶酶原激活剂（t-PA）和尿激酶原（pro-UK）等，但它们均在不同程度上存在一定的缺陷，如毒性强、副作用大，在体内半衰期短，来源紧缺、价格昂贵，应用范围有限，推广受到严重制约。
1986年，日本的须见洋行教授等发现日本的传统食品纳豆可以有效溶解血栓［3］，并于1987年成功地从纳豆中分离山了纳豆激酶（Nattokinase，NK），经过研究确定其为一种具有高纤溶活性的激酶，可用于治疗和预防心脑血管栓塞性疾病的发生，并且在国外，2004年OmuraK等人的临床试验已经证实了这一点［4］。纳豆是由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在一定温度、湿度条件下发酵大豆而来，经发酵后的纳豆可溶性总氮及多种氨基酸含量明显增高，富含包括纳豆激酶在内的多种生物活性酶以及多种维生素，因而具有降血压、抗氧化、抗肿瘤及重要的溶血栓等医药功效［5］。纳豆激酶来源于食品，无毒副作用，而且价廉易得，为此开发溶栓纳豆保健食品具有实用价值。本文旨在对产纳豆激酶菌株进行筛选、鉴定，以获得理想的纳豆发酵生产用菌种。
1  材料与方法
1.1  材料及试剂
1.1.1  菌种
本试验室自纳豆中筛选的出发菌群N-B、N-3、N-4、N-Z及枯草芽孢杆菌。
1.1.2  主要试剂
纤维蛋白原（Fibrinogen）、凝血酶（Thrombin）均购自Sigma公司；尿激酶（Urokinase）购自黑龙江迪龙制药有限公司。其他试剂均为市售分析纯。
1.2  培养基
斜面培养基：琼脂粉2%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl0.5%，pH7.0～7.2。
初筛培养基（酪蛋白培养基）：琼脂2%，酪素0.5%，葡萄糖0.1%， 酵母膏0.1%， K2HPO40.1%， KH2PO40.05%，MgSO40.01%，水1000ml，pH7.0～7.2。
种子培养基：大豆蛋白胨1%，葡萄糖1%，Na2HPO4
0.2%，NaH2PO40.1%，CaCl20.2%，MgSO40.05%，pH7.0～7.2。
液体发酵培养基：大豆蛋白胨2%，葡萄糖2%，Na2HPO40.2%，NaH2PO40.1%，CaCl20.2%，MgSO4
0.05%，pH7.0～7.2。
1.3  试验方法
1.3.1  菌株的分离与初筛
将菌种加入无菌生理盐水中振荡30min，进行稀释平板分离，涂布于酪蛋白平板，37℃下培养36h，选取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落进行连续分纯与继代后，作为初筛得到的菌株保藏备用。
1.3.2  菌株的复筛
将初筛菌株接入液体种子培养基（装液量30ml/250ml），37℃、180rpm恒温培养24h，最终活菌数约为108cfu/ml。以2%接种量接种至液体发酵培养基（装液量50ml/250ml），37℃、180rpm恒温培养。24h后取发酵液，3500rpm离心10min。取上清液10μl点样与纤维蛋白平板上，37℃，恒温18h后测量每个样品的溶解透明圈直径，计算酶活。
1.3.3  纳豆激酶活性的测定
（1）纤维蛋白原平板的配制
①巴比妥钠缓冲液的配制：将169ml 0.1M盐酸加入331ml 0.1M巴比妥钠溶液中，然后用160ml水稀释，即为0.05mol/L pH7.8的巴比妥钠缓冲液。
②将60mg纤维蛋白原溶于24ml pH7.8的巴比妥钠缓冲液中，得2.5mg/ml的纤维蛋白原缓冲液。
③将210U凝血酶溶于7ml pH7.8的巴比妥钠缓冲液中，制得30U/ml的凝血酶缓冲液。
④将6ml的纤维蛋白缓冲液加入直径为60mm的无菌平皿中，再加入0.3ml的30U凝血酶缓冲液，小心振荡使之混匀，25℃下过夜，使之生成乳白色薄层。
（2）标准曲线的制作
将尿激酶样品（100、200、300、400、500U/ml）各10μl点样于新配制的纤维蛋白平板上，放置10min，移入37℃培养箱，保温18h后取出，测定溶圈的直径，计算各溶圈面积。以溶圈面积为横坐标，以酶活力为纵坐标作图，根据标准曲线计算样品活力。
1.3.4  固态发酵感观评价方法
选择无虫咬、无霉烂、吸水能力强、保水能力高、含杂质量少、黄色、脐成白色或浅褐色、粒型饱满、整齐一致的大豆，以小粒或极小粒为佳。
大豆清洗干净，三倍水15℃浸泡22h，高温灭菌锅中121℃蒸煮30min。
120g大豆加入10ml种子液，充分混匀，在40～42℃下发酵24h，4℃下后熟24h。
感官的评价采用四个指标：拉丝（粘度）、色泽、气味和口感。每个指标分五级，定义10分最优，2分最差，分别由五个人品评，然后取其平均值。选择湿润、拉丝长、色泽金黄、口感润滑和纳豆激酶酶活大的菌株，确定为纳豆生产菌。
1.3.5  菌株的生理生化鉴定
菌体形态特征和生理生化特征测定参照文献资料［6-9］进行。
2  结果与分析
2.1  高酶活菌株的分离与筛选
纳豆激酶是一种中性丝氨酸蛋白酶［10］，可水解酪素形成透明圈，根据这一特性，采用水解酪蛋白平板从四株出发菌群中分离出271株具有较高蛋白酶活力的菌株初筛，再经纤维蛋白平板复筛多次，获得24株高纤溶活性有效菌株，最终复筛出的4411、B45、481、465四株菌株纳豆激酶相当于尿激酶的酶活分别达到了1227.27U/ml、1199.04U/ml、963.53U/ml、1084.84U/ml，与国内文献［11,12］报道的酶活比较，属于高产菌株，因此作为进一步的研究菌株，结果如图2。
2.2  感官评价
纳豆的特点是发酵后会产生大量粘性物质，其成分是多肽和多糖等物质，组成多肽的氨基酸主要是γ-多聚谷氨酸［13］，组成多糖的主要是果糖，前者的粘性较后者强，但后者起稳定粘性的作用。这种粘性物质使纳豆在拨动时相互之间产生长长的细丝，故粘性物质的粘度是评价纳豆好坏的一个重要指标。对由4411、B45、481、465固体发酵生产的纳豆进行感官评价，生产的纳豆颜色略显土黄，有金属光泽，豆粒酥软、表面附有一层的白色粘性物质，其中由465发酵的纳豆拉丝较长，气味浓郁，略带氨臭味。我们根据纳豆的原料全部为大豆，含氮量比较高，判断可能是产生氨臭味的主要原因［14］。童军锋等［15］认为，氨是在发酵中期由氨基酸分解产生的，而质量较好的纳豆应尽量减少这种氨臭味。在今后的研究中可以通过加入不同的碳源调整原料C/N来有效抑制纳豆散发的氨臭味，达到改善纳豆风味的目的，可以克服只用调味剂和香精香料来掩盖不良气味的局限。考虑到发酵后的感观结果，我们选择了4411、465作为生产纳豆用菌株，如图3。
2.3  菌种鉴定
2.3.1  菌落形态
观察营养琼脂平板上和试管液体的培养24h的4411、465和枯草芽孢杆菌的菌落形态特征，结果见表1。从表中可看出筛选到的菌种在菌落形态上与枯草芽孢杆菌比较相似。
表1  菌落形态特征比较
                                 琼脂平板上菌落特征                                          试管液体中培养特征
 菌种 形状 质地 边缘 光学特征 颜色 分泌色素 菌落大小（mm） 菌膜 浑浊   沉淀
 4411   圆形   表面皱褶   整齐   不透明   乳白   否  2.20×2.34   皱褶   否   无
 465   圆形   表面皱褶   不整齐   不透明   乳白   否   2.18×2.09   皱褶   否   无
 枯草杆菌   圆形   表面皱褶   不整齐   不透明   乳白   否   1.94×2.01   皱褶   否   无

2.3.2  个体形态
对培养24h的4411、465菌体细胞进行个体形态观察，并与枯草芽孢杆菌比较，可以发现革兰氏染色呈阳性，有芽孢，且芽孢中生，可将4411、465归为芽孢杆菌属，见表2。
表2  菌体特征比较
 菌种  菌体   芽孢    鞭毛   运动性
   形状 长（μm） 宽（μm） 形状 位置 大小（μm）
 4411     杆状 2.20     0.75     圆形或椭圆     中生   0.74×1.42   周生     运动
 465     杆状     2.31     0.78     圆形或椭圆     中生   0.79×1.50   周生     运动
 枯草杆菌   杆状     2.19     0.71     圆形或椭圆     中生   0.71×1.50   周生     运动

2.3.3  生理生化特征
以枯草芽孢杆菌为参比菌株，对4411、465菌株进行了部分生理生化特征测定、糖发酵试验、渗透压试验，结果见表3。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）对枯草芽孢杆菌的描述，确定4411、465为枯草芽孢杆菌，与参比菌株生化特征基本一致。
表3  生理生化试验
   4411     465     枯草芽孢杆菌
 革兰氏染色      +     +     +
 对氧需求      +     +     +
 酪蛋白水解      +     +     +
 淀粉水解      +     +     +
 明胶液化      +     +     +
 硝酸盐还原      +     +     +
 柠檬酸盐试验     +     +     +
 过氧化氢酶试验     +     +     +
 石蕊牛奶还原     +     +     +
 V-P测定      +     +     +
 MP试验      -    -     -
 尿素利用      -    -     -
 
 糖 葡萄糖  +     +     +
 发 果糖 +     +     +
 酵 蔗糖 +     +      +
 试 麦芽糖 +     +     +
 验 乳糖 +     +     +
  木糖 +     +     +
  甘露醇 +     +     +
 渗 0.5%NaCl ++     ++     ++
 透 3%NaCl ++     +     +
 压 6%NaCI +     + +
 试 9%NaCI +     +     +
 验 12%NaCl +     +     -
  15%NaCl     -     -     -
  18%NaCl     -     -     -

3  讨论
心脑血管疾病正日益严重地危害着人们的健康，已成为人类死亡的主要原因之一，这其中约有80%的病例是由于血管中形成血凝块（血栓）而导致的突发性恶果。本研究从纳豆中分离和筛选出高纤溶活性的纳豆菌4411、465，并用该菌成功地试制出具有明显纳豆典型特征的纳豆食品。通过系统的细菌学和生理生化鉴定表明，筛选分离到的2株菌4411、465彼此的性状差异较小，具有枯草芽孢杆菌的典型性状，且与枯草芽孢杆菌比较，典型特征差异不明显，基本确认4411、465菌株在分类上归属枯草芽孢杆菌。由于枯草杆菌是公认的安全性细菌［16］，而且该菌株又来源于食品，因此，4411、465完全可以直接用于保健纳豆的生产和开发。有理由相信其在心脑血管栓塞症及血栓性老年痴呆症预防方面将起到一定的积极作用，但作为溶栓药物，其酶活还有待进一步的提高。◇

参考文献
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作者简介：马明（1981～  ）男，山东莱阳人，在读硕士研究生，主要研究方向为食品发酵工程。
*通讯作者：杜金华，教授。